背景与目的：　　MicroRNA(miRNA)是一类非编码的小分子RNA，长度约22nt，其能与靶基因的3’UTR端配对结合导致信使RNA降解或抑制其翻译，发挥癌基因或者抑癌基因的作用。至今报道基因组编码的miRNA已经超过1000个，约占人类基因的5％左右，人类基因中1/3都受到 miRNA的调控。大量研究证实 miRNA参与细胞分化、增殖、凋亡或坏死等生命活动的调节，miRNA与人类的生命活动和疾病关系密切，尤其是在癌症的发生与发展中。泛素-蛋白酶体水解系统（UPS）是蛋白质的选择性降解中一种非常重要的机制,它通过选择性的降解蛋白质而控制着体内许多重要的生物学过程，包括细胞周期的调控、抗原提呈、转录调控、凋亡等。许多疾病的发生都是由于此途径的异常引起的。蛋白酶体抑制剂能够广泛抑制泛素-蛋白酶体系统的作用，导致泛素-蛋白酶体系统的底物蛋白在细胞内积聚，造成细胞稳态的失衡，由此诱导细胞的凋亡，最终产生抗肿瘤的作用。硼酸肽是重要的蛋白酶体抑制剂，在体外细胞和动物体内实验都表明有其有较强的蛋白酶体抑制活性，并且具有高度的酶选择性。肽硼类代表性抑制剂 Bortezomib(VELCADE，PS-341)是第一个进入临床研究的蛋白酶体抑制剂。近年来利用 miRNA的负调节作用来调控蛋白表达合成，用以达到疾病治疗的目的，正成为研究热点。但蛋白降解调控对 miRNA的调节作用尚未见报道。本实验室前期研究发现，不同的蛋白酶体抑制能影响肿瘤细胞内多个miRNA表达，其中miR-625-3p明显上调，由此我们假设蛋白降解抑制通过诱导 miRNA表达而负反馈抑制蛋白合成，从而对细胞起保护作用，当使用其miRNA抑制物就能阻断其对蛋白表达的负调节作用，从而增强蛋白酶体抑制剂抗肿瘤的作用，提高特异性并降低毒性，这对临床上肿瘤以致其他蛋白异常所致疾病的治疗有着极其重要的指导作用和广泛的应用前景。本课题围绕miR-625-3p展开了研究并进一步探讨了其作用机制。　　实验方法：　　（一）miRNA表达检测：采用实时荧光定量聚合酶链反应方法；　　（二）细胞活力及增殖抑制试验：采用MTS法；　　（三）细胞增殖能力检测：采用集落形成改变实验；　　（四）细胞凋亡情况检测：采用AnnexinV-FITC-PI双染标记荧光显微镜拍照；　　（五）细胞内蛋白质分子检测：采用Western blot方法；　　（六）靶点筛选：采用荧光素酶报告基因活性检测。　　实验结果：　　（一）实时荧光定量PCR检测miR-625-3p表达水平　　随着 PS-341浓度的增加，miR-625-3p的表达水平增加，是对照组的1.1、1.3、2.0倍，定量实验结果与芯片结果一致。与NC mimic组相比，转染miR-625-3p mimic组的miR-625-3p表达水平明显升高；与NC inhibitor组相比，转染miR-625-3p inhibitor组的miR-625-3p表达水平明显下降。　　（二）外源性高表达miR-625-3p对肿瘤细胞的影响　　外源性高表达miR-625-3p对肿瘤细胞增殖活力的影响：对HepG2细胞分别转染NC inhibitor、miR-625-3p inhibitor、NC mimic、miR-625-3p mimic（抑制剂转染浓度分别为52.8、66、99nM，对应的模拟物转染浓度为26.4、33、49.5nM），24h后进行活力检测发现转染miR-625-3p inhibitor对HepG2细胞有明显的抑制作用，其抑制增殖作用呈剂量依赖性，转染miR-625-3p mimic无出现增殖抑制，而在高浓度转染时对细胞活力具有促进作用。　　外源性高表达 miR-625-3p后细胞集落形成改变：与 NC inhibitor组比较，转染miR-625-3p inhibitor细胞集落形成减少，集落形成率明显降低，结果表明抑制miR-625-3p能抑制肿瘤细胞增殖，降低肿瘤细胞恶性程度。　　（三）miR-625-3p与蛋白酶体抑制剂PS-341联合对肿瘤细胞的作用　　miR-625-3p与PS-341联合对肿瘤细胞增殖抑制的作用：对HepG2细胞以上述3个转染浓度分别转染NC inhibitor、miR-625-3p inhibitor、NC mimic、miR-625-3p mimic24h后分别加入蛋白酶体抑制剂PS-34125、50、75nM作用24h后检测，发现随着药物浓度的增加，转染miR-625-3p inhibitor组细胞活力逐渐下降，而转染miR-625-3p mimic组细胞活力有所好转。药物作用48h后转染miR-625-3p inhibitor组细胞活力进一步下降。对MCF-7细胞以抑制剂转染浓度为66nM，模拟物浓度33nM，同样条件转染24h后加入蛋白酶体抑制剂PS-34150nM作用24h/48h发现转染miR-625-3p inhibitor组细胞活力下降明显。　　miR-625-3p与PS-341联合对肿瘤细胞死亡诱导作用：显微镜下观察到，对于HepG2细胞，在转染 miR-625-3p inhibitor组，皱缩形态死亡均比 NC inhibitor组显著。AnnexinV-FITC-PI标记的凋亡结果显示，在转染miR-625-3p inhibitor组中细胞被标志的绿色和红色荧光比对照组增多，说明细胞凋亡增多，尤其在与PS-34150nM联合组，细胞凋亡最显著。MCF-7细胞实验结果与HepG2一致。　　miR-625-3p与 PS-341联合对肿瘤细胞内蛋白分子表达变化：在 HepG2细胞，与NC inhibitor组比较，转染miR-625-3p inhibitor的UPS系统内源性蛋白Ub、底物蛋白P27明显增多，PARP蛋白切割增多，Caspase3前体减少；而转染miR-625-3p mimic能逆转这种效应。MCF-7细胞结果与HepG2细胞结果一致，且在PS-341作用48h时，转染miR-625-3p inhibitor的Ub聚集明显比NC inhibitor显著增多，而PARP切割带明显最多。　　（四）miR-625-3p靶点的筛选　　应用PS-341作用肿瘤细胞24h后检测细胞蛋白表达，发现磷酸化的eIF2α增加，提示触发内质网应激反应。对肿瘤细胞转染miR24h后检测蛋白表达，显示miR-625-3p能使eIF2α、Bip表达增加，TRAF2表达减少。应用内质网应激诱导剂Thapsigargin能使一系列PS-341诱导的miR表达上调。荧光素酶报告基因活性检测显示，共转染载体AP-1和miR-625-3p mimic的荧光素酶活性明显增高，而共转染载体NFκB和miR-625-3p mimic的荧光素酶活性亦有所增高，提示 miR-625-3p可能通过某些机制激活 AP-1、NFκB细胞信号通路实现其生物学作用。　　结论：　　1.抑制miR-625-3p能有效诱导肿瘤细胞生长抑制，增强蛋白酶体抑制剂PS-341诱导的细胞毒性；　　2.miR-625-3p对肿瘤细胞具有保护作用；　　3.miR-625-3p的作用靶点可能在ERS信号通路上。