目的:糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetesmellitus，DM)最常见的微血管并发症之一，是目前我国慢性肾衰竭的主要原因之一，探寻DN发病机制及有效防治措施的意义不言而喻。中医药在防控DN方面，已显现出较大优势。现代中医肾病学者大多认为，DN除有DM“气阴两虚”的病机外，其主要病机是瘀血阻于肾络，DN治疗多遵循活血化瘀通络法则，已成为中医肾病领域的共识。现代医学证实，肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)的激活是参与DN发病机制的主要因素，基于对DN过程中RAS经典途径ACE-AngⅡ-AT1通路过度激活的认识，血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin convertingenzyme inhibitor，ACEI)、血管紧张素受体拮抗剂（angiotensin receptorblocker，ARB）已成为现代医学临床治疗和延缓DM肾损害的一线药物。然而，随着对RAS的深入研究发现，RAS的另一条功能轴——ACE2-Ang-(1-7)-Mas轴，可与ACE-AngⅡ-AT1轴相对抗。维持和调整RAS两条代谢通路的平衡成为治疗DM肾脏损伤的新理念。本研究拟以瘀血阻络证候和ACE2-Ang-(1-7)-Mas轴为主要切入点，通过动物实验及小鼠足细胞的离体培养，探索DN瘀血阻络证是否与RAS中ACE2-Ang-(1-7)-Mas轴功能失调存在关联，以及化瘀通络中药对DN瘀血阻络证的干预作用是否同时改善ACE2-Ang-(1-7)-Mas轴的功能失调。　　方法:　　1、糖尿病肾病大鼠瘀血阻络证的确认　　健康雄性SD大鼠32只，4w龄，80～100g，适应性喂养1w后，随机分为空白对照组（C组，n=8）、高糖高脂对照组（H组，n=10）和模型组（M组，n=14），C组大鼠予普通全价颗粒饲料喂养，其余大鼠均予高糖高脂饲料喂养。4w后，M组大鼠腹腔注射1％链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)溶液(40mg/kg体重)，72h后随机血糖＞16.7mmol/L为DM大鼠模型复制成功;C、H两组大鼠均腹腔注射相应体积的0.1M枸橼酸缓冲液。于注射STZ后第3d、4w、8w、16w末，测量各组大鼠的随机血糖。16w末收集大鼠24h尿液（检测尿蛋白定量）后，麻醉状态下腹主动脉取血，检测各组大鼠血液流变学指标、血脂和血小板参数，留取各组大鼠肾皮质，行光镜、透射电镜观察。　　2、化瘀通络中药对糖尿病肾病大鼠瘀血阻络证的干预作用　　将实验大鼠40只，随机分为C组(n=10)和STZ注射组(n=30)。STZ注射组的模型复制方法同上。将模型复制成功的25只DM大鼠分为M组(n=12)和化瘀通络中药组（Z组，n=13）。用药剂量按照成人临床常用剂量的5.8倍计算，给予Z组大鼠中药颗粒剂混悬液灌胃（1.08g/kg体重，相当于饮片4.7g/kg体重），其余组大鼠给予相应体积饮用水灌胃，每日1次，连续16w。16w末，腹主动脉取血，检测各组大鼠血液流变学指标、血脂、血小板参数、血浆纤维连接蛋白(fibronectin，FN)含量(ELISA法)，并冻存部分肾皮质，采用实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测组织型纤溶酶原激活物(tissue plasminogen activator，t-PA)、纤溶酶原激活物抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)mRNA的表达。　　3、糖尿病肾病瘀血阻络证大鼠肾皮质ACE2-Ang-(1-7)-Mas轴的变化及化瘀通络中药的干预作用　　将实验大鼠93只，随机分为C组(n=22)和STZ注射组(n=71)，模型复制方法同上，将成模DM大鼠62只随机分为M组(n=24)、厄贝沙坦组（I组，n=19）和Z组(n=19)，给予相应药物灌胃干预。于注射STZ后4w末随机取C组、M组大鼠各6只处死，其余各组大鼠分别于8w、16w末分两次处死，取肾皮质组织，采用免疫组织化学法和蛋白印迹(western blot)检测肾皮质ACE2、Mas、ACE蛋白的表达，real-time PCR检测肾皮质ACE2、Mas、ACE mRNA的表达，ELISA法检测肾皮质Ang-(1-7)的含量。　　4、化瘀通络中药对糖尿病肾病瘀血阻络证肾损伤的干预作用　　将实验大鼠57只，随机分为C组(n=10)和STZ注射组(n=47)，模型复制、成模DM大鼠分组及干预方法同上。于注射STZ后第3d、4w、8w、16w末，动态计量各组大鼠体重、24h摄食量、饮水量、尿量和24h尿蛋白定量。16w末处死动物，腹主动脉取血，检测肾功能;称量肾重，计算肾脏指数(kidney index，KI);留取肾皮质，通过光镜、透射电镜检测各组大鼠肾脏病理表现。　　5、化瘀通络中药对高糖刺激下足细胞的干预作用　　将许可条件下培养的条件性永生化小鼠足细胞分为正常糖组(NG组)、高糖组(HG组)和12个药物浓度的高糖加药组分别给予相应干预24h、48h、72h，通过MTT试验观察不同药物浓度对高糖刺激下细胞增殖的影响，对比结果筛选最佳药物浓度。将非许可条件下分化成熟的小鼠足细胞分为NG组、HG组和最佳药物浓度的高糖加药组[HGG+Z）组]，分别给予相应干预24h、48h、72h，检测细胞上清液Ⅳ型胶原蛋白(collagen-Ⅳ，Col-Ⅳ)的含量;采用免疫细胞化学法和western blot检测足细胞ACE和ACE2蛋白的表达，real-time PCR检测足细胞ACE、ACE2mRNA的表达。　　结果:　　1、糖尿病肾病大鼠瘀血阻络证的确认　　1.1一般情况　　与C、H两组大鼠比较，M组大鼠逐渐出现多饮、多食、多尿及体重降低的表现。C组大鼠爪心红润，尾部静脉暗红不显;H组与C组差异不明显;而M组大鼠爪心紫暗，尾部静脉深紫而清晰可见。　　1.2随机血糖　　C、H两组大鼠的血糖基本恒定，H组大鼠的血糖高于C组（P＜0.01）;腹腔注射STZ后，M组血糖水平显著高于同时间点C、H两组(P＜0.01)。　　1.324h尿蛋白定量　　16w末，C、H两组间UPE无统计学差异(P＞0.05);与C、H两组比较，M组大鼠尿蛋白显著增加(P＜0.01)。　　1.4病理形态学　　C、H两组大鼠肾脏体积正常，表面光滑，肾小球结构正常、清晰，足突排列整齐、无融合;M组大鼠肾脏体积增大，、表面不平滑且有苍白花斑，肾小球肿胀肥大，基底膜均质性增厚且结构杂乱，系膜基质增多，足突节段性融合。　　1.5血液流变学指标　　16w末，H组仅红细胞压积(hematocrit，HCT)低于C组(P＜0.05)。与C组比较，M组大鼠各切变率全血粘度、血浆粘度和全血低切还原粘度均明显升高（P＜0.01），HCT、红细胞变形指数(erythrocyte deformabilityindex，EDI)均明显降低(P＜0.05或0.01);其中，全血粘度、血浆粘度和EDI还同时与H组具有统计学差异(P＜0.05或0.01)。　　1.6血脂　　16w末，H组血总胆固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白(lowdensity lipid cholesterol，LDL)和高密度脂蛋白（high density lipidcholesterol，HDL）均高于C组(P＜0.05或0.01)，而甘油三酯(triglyceride，TG)和极低密度脂蛋白(very low density lipid cholesterol，VLDL)则与C组无明显差异(P＞0.05)。与C、H两组比较，M组大鼠TC、TG、LDL、HDL和VLDL均明显升高(P＜0.01)。　　1.7血小板参数　　16w末，H组仅平均血小板体积(mean platelet volume，MPV)高于C组(P＜0.05)。与C组比较，M组血小板计数(platelet count，PLT)明显减少(P＜0.01)，MPV和血小板分布宽度(platelet distributing width，PDW)显著增高(P＜0.01);其中，PLT、MPV同时与H组具有显著差异(P＜0.05或0.01)。各组间大型血小板比率(platelet-large cell ratio，P-LCR)无明显差异（P＞0.05）。　　2、化瘀通络中药对糖尿病肾病大鼠瘀血阻络证的干预作用　　2.1一般情况　　C组大鼠爪心红润，尾部静脉暗红不显;M组大鼠爪心紫暗，尾部静脉深紫而清晰可见;I、Z两组大鼠爪心和尾部静脉较M组有所改善。　　2.2血液流变学指标　　16w末，与C组比较，M组大鼠各切变率全血粘度、血浆粘度和全血低切还原粘度均明显升高(P＜0.01)，HCT、红细胞变形指数(erythrocytedeformability index，EDI)均明显降低(P＜0.01);与M组比较，Z组切变率30S-1、200S-1全血粘度、血浆粘度和EDI均有显著改善(P＜0.05或0.01)。　　2.3血脂　　16w末，与C组比较，M组大鼠TC、TG、LDL、HDL和VLDL均明显升高(P＜0.01)。与M组比较，Z组以上各血脂指标均显著降低(P＜0.05或0.01)。　　2.4血小板参数　　16w末，与C组比较，M组血小板计数(platelet count，PLT)明显减少(P＜0.01)，MPV和血小板分布宽度(platelet distributing width，PDW)显著增高(P＜0.05或0.01);与M组比较，Z组MPV、PDW均明显降低(P＜0.01)。各组间大型血小板比率(platelet-large cell ratio，P-LCR)无明显差异（P＞0.05）。　　2.5血浆FN含量　　16w末，M组血浆FN含量明显高于C组(P＜0.01);与M组比较，Z组含量明显降低(P＜0.05)。　　2.6肾皮质t-PA、PAI-1 mRNA的表达　　16w末，各组t-PA mRNA的表达无明显差异（P＞0.05）;M组PAI-1mRNA的表达显著高于C组(P＜0.05)，而Z组的表达低于M组(P＜0.05)。　　3、糖尿病肾病瘀血阻络证大鼠肾皮质ACE2-Ang-(1-7)-Mas轴的变化及化瘀通络中药的干预作用　　3.1肾皮质ACE2、Mas、ACE的表达　　ACE2和ACE主要表达在各组大鼠肾小球和肾小管的上皮细胞中，Mas主要表达在各组大鼠肾皮质组织的近端小管。　　C组大鼠各时间点肾皮质ACE2、Mas和ACE蛋白的表达均无显著差异(P＞0.05)。M组大鼠肾皮质ACE2、Mas蛋白的表达均随时间呈现降低趋势:16w末ACE2蛋白的表达低于4w末(P＜0.05);16w末Mas蛋白的表达分别低于4w末和8w末(P＜0.05或0.01)。M组不同时间点ACE蛋白的表达无统计学差异(P＞0.05)。　　8w末，ACE2和Mas蛋白在各组大鼠肾皮质组织的表达水平，无统计学差异(P＞0.05);ACE蛋白的表达水平仅在M、I两组间存在差异(P＜0.05)。　　16w末，肾皮质ACE2蛋白的表达，M组低于C组(P＜0.01), I、Z两组均高于M组（P＜0.05），且Z组高于I组(P＜0.05); Mas蛋白的表达，M组低于C组(P＜0.05);I、Z两组均高于M组(P＜0.01)。ACE蛋白的表达，M组显著高于C组(P＜0.01);Z组低于M、I两组(P＜0.05或0.01)。　　3.2肾皮质ACE2、Mas、ACE mRNA的表达　　以4w末C组大鼠作为参照，进行相对表达定量。C组大鼠各时间点肾皮质ACE2、Mas、ACE mRNA的表达无显著差异(P＞0.05)。M组各时间点ACE2 mRNA的表达均低于同时间点C组(P＜0.01)，在4w至16w之间先上升(P＜0.01)、后下降(P＜0.05);M组Mas mRNA的表达在4w高于C组(P＜0.01)，在4w至16w之间持续下降(P＜0.01)，16w低于C组(P＜0.05);M组ACE mRNA的表达在4w低于C组(P＜0.01)，在4w至16w之间先上升(P＜0.01)、后下降(P＜0.05)，8w、16w均高于C组(P＜0.05或0.01)。　　8w末，各组Mas mRNA的表达无显著差异(P＞0.05)。与C组比较，M组ACE2 mRNA的表达显著降低(P＜0.01)，ACE mRNA的表达显著升高(P＜0.01);与M组比较，Z组ACE2 mRNA的表达显著升高(P＜0.01)，且高于I组（P＜0.05）;I、Z两组ACE mRNA的表达均低于M组(P＜0.05)。　　16w末，与C组比较，M组ACE2 mRNA的表达显著降低(P＜0.01)，ACE mRNA的表达显著升高(P＜0.05)，而Mas mRNA的表达无显著差异（P＞0.05）;与M组比较，Z组ACE2和Mas mRNA的表达均显著升高(P＜0.05或0.01);其中，Z组Mas mRNA的表达还同时高于I组(P＜0.05);M、I、Z三组间ACE mRNA的表达差异不明显(P＞0.05)。　　3.3肾皮质Ang-(1-7)的含量　　16w末，与C组比较，M组大鼠的肾皮质Ang-(1-7)含量明显降低(P＜0.01);而I、Z两组的Ang-(1-7)含量均高于M组(P＜0.01)。　　3.4 M组大鼠血液粘度与ACE2、Mas和ACE mRNA及其蛋白表达的线性相关分析　　16w末，M组大鼠血浆粘度和不同切变率下全血粘度与肾皮质ACE2mRNA及其蛋白的表达均呈负相关(P＜0.05或0.01)，与ACE mRNA及其蛋白的表达均呈正相关(P＜0.05或0.01);而与Mas mRNA及其蛋白的表达无显著线性相关关系(P＞0.05)。　　4、化瘀通络中药对糖尿病肾病瘀血阻络证肾损伤的干预作用　　4.1糖尿病症状性指标的动态变化　　腹腔注射STZ4w后，M组大鼠各时间点体重均明显低于同时间点C组(P＜0.01);16w末，I、Z两组体重均明显高于M组(P＜0.05或0.01)。与同时间点C组比较，M组各时间点RBG、24h摄食热量、饮水量和尿量均显著升高(P＜0.01);与同时间点M组比较，I、Z两组各时间点RBG、24h摄食热量和尿量均无明显差异(P＞0.05)，仅8w末I、Z两组和16w末Z组24h饮水量显著低于同时间点M组(P＜0.05或0.01)。　　4.224h尿蛋白定量的动态变化　　M组大鼠各时间点尿蛋白均高于同时间点C组(P＜0.01);8w末，I、Z两组尿蛋白明显低于M组(P＜0.05或0.01);16w末，Z组显著低于M、I两组(P＜0.05或0.01)。　　4.3肾功能　　16w末，M组血肌酐(serum creatinine，Scr)、尿素氮(blood ureanitrogen，BUN)、尿酸(uric acid，UA)均高于C组(P＜0.01);与M组比较，I、Z两组Scr、BUN均有显著改善(P＜0.05或0.01)，Z组UA也低于M组(P＜0.05)。　　4.4肾脏指数　　16w末，M组KI值明显高于C组(P＜0.01);而I、Z两组KI值均显著低于M组(P＜0.05)。　　4.5光镜观察肾皮质结构　　C组肾皮质结构正常;M组肾小球肾小球体积肥大，基底膜轻度增厚，系膜轻度增生，毛细血管管腔扩张，肾小囊腔狭窄，肾小管上皮细胞排列紊乱、肥大;I、Z两组的肾小囊腔较宽，系膜增生有所改善。　　4.6透射电镜观察肾小球超微结构　　C组肾小球超微结构基本正常;M组大鼠肾小球基底膜均质性增厚且结构欠清晰，系膜基质增多，足突节段性融合;I、Z两组结构较清晰，基底膜节段性增厚，足突少部分融合。　　5、化瘀通络中药对高糖刺激下足细胞的干预作用　　5.1 MTT试验　　HG组各时间点光密度（optical density，OD）值均明显低于同时间点NG组(P＜0.05或0.01);多个药物浓度均对高糖刺激24h、48h、72h对足细胞的增殖抑制有不同程度的逆转作用，其中，各时间点均以药物浓度100ug/ml的含药高糖组的OD值最高，且高于HG组(P＜0.01)。以100ug/ml作为最佳给药浓度。　　5.2细胞上清液Col-Ⅳ的含量　　给予足细胞不同干预24h后，各组细胞上清液Col-Ⅳ的含量无显著差异(P＞0.05);不同干预48h、72h后，HG组细胞上清液Col-Ⅳ的含量均高于同时间点NG组(P＜0.01)，而(HG+Z)组干预48h后Col-Ⅳ的含量显著低于HG组(P＜0.05)。　　5.3足细胞ACE、ACE2蛋白的表达　　ACE和ACE2蛋白特异性表达于足细胞胞浆中。不同干预48h，与NG组比较，HG组ACE蛋白表达显著升高(P＜0.05)，ACE2蛋白表达显著降低(P＜0.01);与HG组比较，（HG+Z）组ACE蛋白表达较低，而ACE2蛋白表达较高(P＜0.05)。而不同干预24h、72h后，各组ACE2、ACE蛋白的表达均无明显差异（P＞0.05）。　　5.4足细胞ACE、ACE2 mRNA的表达　　分别与同时间点NG组比较，HG组各时间点ACE mRNA表达均显著升高（P＜0.05），HG组24h、48h ACE2 mRNA表达显著降低(P＜0.05或0.01);分别与同时间点HG组比较，仅48h(HG+Z)组ACE mRNA表达明显降低，ACE2 mRNA表达明显升高(P＜0.01)。　　结论:　　1、DN大鼠爪掌、尾静脉有紫暗瘀血表现，血液存在高粘、高凝状态，与瘀血阻络的中医证候特征相符，确认了DN瘀血阻络证的存在。　　2、化瘀通络中药对DN大鼠瘀血阻于肾络的证候具有良性调节作用。　　3、DN大鼠肾皮质ACE2-Ang-(1-7)-Mas轴功能下调，化瘀通络干预16w可不同程度上调其功能，且作用优于对照药物厄贝沙坦。　　4、化瘀通络中药能有效减轻DN瘀血阻络证大鼠的肾损伤，且作用略优于对照药物厄贝沙坦。　　5、高糖刺激对小鼠足细胞具有抑制增殖、促进Col-Ⅳ分泌、上调ACE、下调ACE2表达的效应;化瘀通络中药干预48h能不同程度逆转以上效应。