杆状病毒(Baculovirus)是一种自然感染节肢动物的有囊膜DNA病毒。杆状病毒基因组可以容纳高达38kb的外源基因片段插入,并且在合适的启动子控制下可以介导外源基因在哺乳动物体内进行表达,从而诱导机体产生免疫应答,而且杆状病毒在哺乳动物体内不能复制和转录,具有良好的生物安全性;此外杆状病毒可以刺激固有免疫系统,具有良好的佐剂效果。因此,杆状病毒具有成为一种理想的候选疫苗载体的潜力,目前已经被应用于多种动物疾病的基因工程疫苗的研究。尽管具有以上优点,但是杆状病毒系统存在的两个主要缺陷严重限制了其大规模推广应用。首先,杆状病毒系统生产外源蛋白的产量较低,导致了其生产动物疫苗的成本居高不下,使得杆状病毒基因工程疫苗的价格一直比较昂贵,严重制约了杆状病毒基因工程疫苗在许多养殖场中的推广应用。其次,杆状病毒很容易会被哺乳动物血清中的补体系统所清除,导致杆状病毒载体疫苗在哺乳动物体内的免疫时间和免疫效果都受到严重影响。因此,为了突破上述制约因素对杆状病毒系统的限制,为研制出安全高效的新型杆状病毒动物疫苗提供科学依据,本研究通过三个方面对杆状病毒系统进行了研究,并以猪瘟为动物疾病病例探究了新型杆状病毒载体疫苗的免疫效果,取得以下结果:1.本研究基于翻译增强子调控蛋白表达的机理,选取3种翻译增强子Syn21(一段21bp的富含AT的序列)、P10UTR(杆状病毒P10基因的3’非编码区)和IVS(果蝇肌球蛋白的内含子)对传统的杆状病毒载体进行了优化改造,并以GFP为报告基因检验了三种翻译增强子对外源蛋白表达量的影响。结果显示,Syn21可以增强GFP表达量4.04±0.12倍(n=3),P10UTR可以增强GFP表达量1.35±0.02倍(n=3),而IVS却降低GFP表达量至对照载体的0.65±0.02(n=3)。同时,进一步比较发现不同翻译增强子之间具有明显的协助增强作用,Syn21和P10UTR联合使用时达到了最强的增强效果,可以增强GFP表达量4.80±0.08倍(n=3)。在这些研究的基础上,本研究又检验了Syn21和P10UTR联合使用对猪圆环病毒2型衣壳蛋白(Cap)的增强效果。Western blotting和间接免疫荧光结果显示Cap蛋白的产量得到了显著提高,透射电镜观察结果表明Cap蛋白形成病毒样颗粒的能力没有受到影响,而且病毒样颗粒的产量提高了4.09±0.04倍(n=3)。最后,又检验了三种翻译增强子对CMV启动子控制的基因表达的影响,同样发现Syn21和P10UTR具有增强效果。因此,本研究使用翻译增强子Syn21和P10UTR成功建立了一种高效的杆状病毒表达系统,为以后动物疾病亚单位疫苗和病毒样颗粒疫苗的生产提供了有力的工具。2.根据Genebank上已经发表的番茄丛矮病毒(TBSV)全基因序列,合成P19基因并将其克隆至组成型启动子opIE2的转录控制下,然后与GFP SiRNA共同转染来检验P19在Sf9昆虫细胞中是否具有抑制RNA干扰的功能。结果显示使用P19可以明显抑制GFP SiRNA的功能,使GFP的表达量最高可恢复至正常的89.6%,而使用RNA干扰抑制功能丧失的P19突变体则没有效果,这说明P19在Sf9昆虫细胞中可以有效的抑制RNA干扰。在这个研究的基础上,进一步检验瞬时表达P19对重组杆状病毒的病毒增殖滴度和外源蛋白表达量的影响。结果表明病毒感染72h时,瞬时表达P19可以显著提高重组杆状病毒的病毒增殖滴度6.80±0.08倍(n=3),可以提高GFP的表达量达1.81±0.04倍(n=3),提高萤火虫荧光素酶的表达量达2.12±0.02倍(n=3)。进一步分析P19不同表达时相对重组病毒的影响发现,P19表达时相不同,重组病毒的增殖曲线有显著差异,但是外源蛋白表达量之间没有显著差异。3.构建杆状病毒表面展示载体,然后用水泡性口炎病毒VSVG-ED对构建的杆状病毒表面展示载体进行假型化修饰,同时将合成的4个补体抑制剂基因克隆至假型化修饰后的杆状病毒表面展示载体中,然后构建新的重组病毒。激光共聚焦显微镜结果显示补体抑制剂已经成功展示于Sf9昆虫细胞的细胞膜。用小鼠和仔猪的血清处理重组病毒发现,表面展示OMCI、pFc和DAF的重组杆状病毒对小鼠血清灭活的抵抗力得到显著提高,存活率分别达到了39.3%、65.6%和90.2%,而对照病毒只有9.4%;表面展示pFc、OMCI和SPICE的重组杆状病毒对猪血清灭活的抵抗力得到显著提高,存活率分别达到了75.6%、42.3%和36.5%,对照病毒只有10.2%。这个结果说明展示补体抑制剂的假型化修饰重组杆状病毒可以获得对血清补体灭活的抵抗能力,其中表面展示DAF的假型化修饰重组病毒对小鼠血清补体抵抗能力最强,而表面展示pFc的假型化修饰重组病毒对猪血清补体抵抗能力最强,为以后开发具有拮抗补体灭活能力的高效杆状病毒载体疫苗奠定了基础。4.综合前几章研究,以猪瘟病毒为例初步探究了利用新型杆状病毒系统构建的猪瘟疫苗的免疫效果。首先PCR扩增获得猪瘟病毒E2基因序列并克隆至新型杆状病毒载体中,然后构建重组病毒并免疫健康仔猪。试验结果显示,与传统的重组杆状病毒相比,本研究构建的新型杆状病毒诱导产生了更高水平的猪瘟特异性抗体、中和抗体以及IFN-γ,这说明新型杆状病毒系统作为动物疫苗载体具有明显的优势,为下一步猪瘟杆状病毒载体疫苗的研究奠定了基础,也为利用杆状病毒系统生产其它动物疫苗的研究提供了新的工具和平台。