AVBD6对细菌感染和应激的响应及对CLEAP-2表达的影响

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β防御素是一类具有广谱抗菌活性的内源性小分子阳离子抗菌肽。禽类吞噬细胞缺乏氧依赖性杀菌机制,其对细菌的清除更依赖于阳离子抗菌肽。AvBD6是β防御素家族成员之一,是有前景的新型抗生素替代品。  目前,关于禽β防御素的定量研究报道较少,而定量研究是深入理解禽β防御素病理生理学意义及临床应用的基础。因此,本研究拟通过建立检测 AvBD6的夹心ELISA法,检测不同病理生理状态下血清或组织中AvBD6的浓度;同时,还探讨外源性AvBD6对鸡肝脏分泌抗菌肽(LEAP-2)表达量的影响。主要研究结果如下:  1、建立检测AvBD6的夹心ELISA法  鼠源包被抗体的免疫原是KLH偶联的AvBD6的B细胞线性表位(PGPCRW-KLH)。兔源检测抗体的免疫原是KLH偶联的AvBD6的N端(SPIHACRYQRGV-KLH)。包被抗体、检测抗体和辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG的最佳工作稀释倍数,分别为2500、2000和10000。在20~320 ng/mL的线性范围内,标准曲线的回归方程为:y=12024x-2583,(其中y为AvBD6合成肽浓度,x为OD450,R2=0.9842)。  2、不同病理生理条件下AvBD6浓度测定  随沙门氏菌感染时间推移,鸡十二指肠中 AvBD6的浓度(由34.88 ng/mL至122.64 ng/mL)、空肠中AvBD6的浓度(由45.015 ng/mL至183.39 ng/mL)和血清中AvBD6的浓度(由7320.38 ng/mL至7855.56 ng/mL)均呈现上升趋势,且与同时间点的对照组差异显著(P<0.05)。大肠杆菌感染组血清中的AvBD6浓度(7641.49 ng/mL)比同时间点对照组高,且差异显著(P<0.05)。随着冷应激时间延长,血清中AvBD6的浓度(由502.095 ng/mL至1525.75 ng/mL)呈上升趋势,且在刺激12h之后其浓度(3666.12 ng/mL)显著上调。在注射ACTH(25 IU/kgBW)1d后,AvBD6浓度(1245.60 ng/mL)比同时间点的对照组略低,而连续注射5d后,AvBD6浓度(4429.96 ng/mL)升高,但是均与同时间点的对照组差异不显著(P>0.05)。  3、外源AvBD6对鸡肝脏表达抗菌肽的影响  当外源性AvBD6的浓度由20μg/kgBW增高至40μg/kgBW时,应用SABC法检测组织中cLEAP-2表达变化,发现肝脏和小肠中cLEAP-2的表达明显增加,而在脾脏、胸腺、法氏囊仅有少量表达。  本研究初步建立了检测AvBD6的夹心ELISA法,并应用于检测不同病理生理状态下血清或组织中AvBD6浓度。其结果表明,细菌感染(沙门氏菌和大肠杆菌)和冷应激作用均可诱导鸡体内AvBD6表达增加,而ACTH对于AvBD6表达的调节作用不显著;外源性AvBD6升高时,可促进鸡肝脏和小肠中LEAP-2的表达。
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