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细胞因子IK(IKcytokine)是II类主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex, class Ⅱ, MHCII)下调因子,该基因编码的蛋白因含有多个精氨酸(arginine,R)、谷氨酸(glutamic acid,E)和天冬氨酸(aspartic acid, D)残基重复序列又名RED蛋白。MHCⅡ分子只在抗原提呈细胞(antigen-presenting cell, APC)中表达,如巨噬细胞、B细胞、已活化的T细胞、树突细胞等；在不表达MHCⅡ分子的非抗原提呈细胞中,多种细胞因子,如干扰素γ(interferony, IFNy)可诱导MHCⅡ分子的表达。细胞因子IK的功能就是抑制MHCⅡ分子在非抗原提呈细胞中的诱导性表达,对维持免疫系统稳定具有重要作用。本研究通过mRNA差异显示PCR方法(mRNA differential display reverse transcription polymerase chain reaction, mRNA DDRT-PCR)发现ik在牛植入前胚胎发育不同时期差异表达,实时定量PCR(quantitative real-timePCR,qPCR)结果显示在生发泡期卵母细胞(germinal vesicle, GV)、第二次减数分裂中期卵母细胞(second meiotic metaphase, Mil)和2细胞期胚胎中,ik表达量随发育阶段进展而下调；达到8细胞胚胎期,其表达量上调,并且达到植入前各发育阶段中表达量高峰；随后再次下调,到囊胚期时的表达水平低于MII期。据此确定细胞因子ik是一个牛植入前胚胎发育差异表达基因。用IK特异性抗体对体外受精合子、2细胞期、8细胞期胚胎、桑椹胚及囊胚的免疫荧光染色结果显示,IK在8细胞期前的发育阶段中无蛋白表达,从8细胞期开始在细胞核内有少量蛋白表达,至桑椹胚期各细胞核内均有IK蛋白表达,囊胚中滋养外胚层和内细胞团细胞核中均有其蛋白表达。对受精后Oh受精卵进行小干扰RNA(small interference RNA, siRNA)胞质显微注射干扰ik表达,并以注射等量发育液的胚胎为对照组,qPCR检测注射后24h的2细胞胚胎期干扰效率为79%(P<0.01)。统计干扰组与对照组胚胎发育率,发现细胞因子ik在受精卵期的下调可降低卵裂率和8细胞胚胎率(P<0.05),而对囊胚率则无显著影响(P>0.05)。进一步的qPCR显示,在注射后48h的8细胞胚胎期,ik表达量显著上升,且干扰组与正常发育组胚胎中的表达量无显著差异(P>0.05)；囊胚期干扰组胚胎中的ik表达量为正常发育组胚胎中表达量的0.74倍(P<0.01)。对ik干扰的2细胞期胚胎、8细胞期胚胎和囊胚进行免疫荧光染色,染色结果与正常发育胚胎无差别。这表明,在8细胞胚胎期发生的合子基因组激活(zygote genome activation,ZGA)活化了ik基因的转录,新合成的mRNA补充了卵母细胞的ikmRNA储备,对siRNA诱导的沉默进行了补偿；到囊胚期,ik转录减弱,siRNA的干扰效果得以显现。在8细胞期胚胎期前的发育阶段,胚胎中虽然有ik mRNA表达但并没有蛋白表达,然而在这期间干扰ikmRNA导致卵裂率和8细胞胚胎率降低,这表明在这期间可能有免疫荧光染色检测不到的少量IK蛋白表达,并且这少量的IK蛋白对卵裂和8细胞胚胎发育有重要作用。而在8细胞期胚胎中ikmRNA表达量达到高峰并开始有大量蛋白表达,说明ik在8细胞胚胎期有重要作用。由于这些大量表达的mRNA影响了之前siRNA的干扰作用而检测不到干扰效果,因此囊胚发育未受到影响。qPCR对ik下游基因牛Ⅱ类组织相容性复合物bola-drb3(Bos taurus major histocompatibility complex, class Ⅱ, DRB3)及Ⅱ类组织相容性复合物反式活化蛋白ciita (class Ⅱ, major histocompatibility complex, transactivator)的检测结果显示bola-drb3与ciita在GⅤ期、MⅡ期和2细胞胚胎中的mRNA表达量均维持较低水平,而在8细胞期均提高表达且达到峰值,在囊胚中mRNA表达量均降低至与8细胞胚胎前期的表达水平。对ik干扰组胚胎bola-drb3和ciita的qPCR结果显示在2细胞期、8细胞期胚胎和囊胚中,两基因的mRNA表达量均有降低。用CIITA特异性抗体对体外受精2细胞期、4细胞期、8细胞期胚胎、桑椹胚及囊胚和siRNA干扰ik表达的8细胞期胚胎、桑椹胚及囊胚的免疫荧光染色结果显示CIITA在植入前各阶段胚胎中均没有蛋白表达。说明干扰ik表达不会引起胚胎MHCⅡ表达失调。综上所述,在牛植入前胚胎中ik的表达受到严格的调控,不容易受到外源干扰RNA影响,对维持植入子宫时期MHCⅡ分子在胚泡表面不表达或低表达具有重要作用。用实时定量PCR检测细胞因子ik在牛胎儿成纤维细胞中的表达发现其丰度较高,而ciita和bola-drbi没有表达,同时有研究证明ik在Hela细胞中具有激活纺锤体组装检验点(spindle assembly checkpoint, SAC)的功能,因此为了确定细胞因子IK在牛胎儿成纤维细胞中的功能是否与SAC相关,本实验检测了ik过表达和干扰表达对SAC成员mad1、mad2及cdc20表达的影响。结果表明干扰ik表达并不影响SAC成员的mRNA表达水平,而过表达ik则会显著提高SAC关键组分mad2和cdc20的mRNA表达。推断ik对SAC的作用可能不是必要条件而是充分条件,即ik低表达不会抑制SAC功能,但其高表达可以促进SAC功能。本研究从牛胚胎发育和牛胎儿成纤维细胞两个方面检测细胞因子IK的功能,对研究细胞因子的作用提供了依据。