体外受精-胚胎移植过程中,正常受精是指卵子于授精后16-20小时呈现2个清晰的原核(pronuclei,PN),同时有两个的极体(polar body,PB)。此外,单原核(1PN)、三原核(3PN)、多原核(多PN)及未见原核(0PN)受精卵均被认为是异常受精而被丢弃。然而,这种传统的观点正面临更新的挑战。细胞遗传学分析提示0PN及1PN来源胚胎均有一部分是染色体正常胚胎。而且,移植0PN或1PN来源的胚胎获得妊娠且生育正常子代均有报道。文献报道0PN来源胚胎占卵裂期胚胎的12-20%。在IVF周期中,1PN发生率为2.7-5.5%,而在ICSI周期中,1PN的发生率为4.9-11.4%。对于高龄及卵巢功能减退等获卵数少的患者来说,1PN或0PN来源胚胎可能是其获得妊娠的唯一希望。因此,我们有必要对1PN及0PN来源的胚胎从发生的可能影响因素、染色体分析及胚胎质量和临床应用等方面做一研究分析。若要对0PN及1PN来源胚胎的染色体组成做更客观的判断,需要对其进行植入前遗传学筛查(preimplantation genetic screening,PGS)。目前应用较多的检测染色体组成的方法是两种基因芯片,即微阵列比较基因组杂交分析(array comparative genome hybridization,a CGH)、单核苷酸多态微阵列技术(single nucleotidepolymorphism microarray,SNP array)。但基因芯片只能检测已知的序列内的有限变异。同时,因其成本昂贵,操作技术复杂,在一定程度上也限制了芯片技术进一步普及。而二代测序技术(next generation sequencing,NGS)乃是对全部基因组核酸进行全面的读取,因此,它是一个“开放体系”,且可多次进行测序。因此,从本质上讲,其对异常的发现能力和寻找新信息的能力高于基因芯片技术。已有较多的研究证实NGS能有效的诊断卵母细胞及胚胎染色体异常。尚未见到使用NGS技术对0PN来源胚胎的非整倍检测的报道。因此,本研究拟通过对0PN、1PN的发生率进行逻辑回归分析,探讨0PN、1PN发生的相关影响因素;拟通过比较不同原核数目来源的胚胎的移植结局,探讨0PN、1PN胚胎在临床上的实际应用价值;并通过比较不同时期(卵裂期及囊胚期)的胚胎移植结局,探讨囊胚培养在0PN、1PN胚胎移植中的积极作用。同时,通过比较不同原核直径的1PN胚胎质量,探讨利用原核直径来预测1PN胚胎的发育潜能的可行性;并通过NGS检测不同原核来源囊胚的染色体非整倍体率,从遗传学角度探讨0PN、1PN胚胎的临床使用价值。第一部分 IVF周期0PN来源胚胎的临床移植价值研究研究目的:分析IVF周期中0PN来源胚胎产生的相关影响因素及移植0PN来源胚胎的临床治疗结局。研究方法:1.回顾性分析新鲜周期移植卵裂期胚胎临床治疗结局:收集2007年7月至2014年6月期间于郑州大学第三附属医院生殖医学中心实施常规IVF新鲜周期治疗的所有卵裂期胚胎资料。逻辑回归法分析0PN胚胎产生的可能相关影响因素。逻辑回归法分析影响临床妊娠率及活产率的相关因素,明确不同原核数目来源的卵裂期胚胎是否对临床治疗结局产生影响。根据移植胚胎来源不同分为0PN ET组(70周期),0PN+2PN ET组(113周期)和2PN ET组(2628周期)。比较各组的年龄、平均获卵数、移植胚胎数、临床妊娠率、植入率。2.回顾性分析复苏周期移植囊胚的临床治疗结局:收集2014年1月至2015年6月期间于郑州大学第三附属医院生殖医学中心实施冷冻囊胚复苏周期的资料。根据移植囊胚的来源不同分为2PN组(1040周期)和0PN组(51周期)。分析两组的临床妊娠率、植入率及流产率。结果:1.0PN来源胚胎的移植结局回顾性分析了4424个IVF-ET周期。其中0PN来源的胚胎占所有卵裂期胚胎的11.3%(4966/43949)。183个周期中的275个0PN来源胚胎用于移植。单纯移植0PN胚胎的有70个周期,移植112枚0PN胚胎。临床妊娠率是24.3%(17/70),植入率是17.0%(19/112),流产率为11.8%(2/17)。1例异位妊娠,1例因胎盘早剥而死产。活产率是18.6%(13/70)。13个周期活产13个健康子代,未见畸形的发生。2.0PN胚胎发生率的相关因素分析逻辑回归分析结果提示患者的年龄、获卵数及2PN率与0PN的发生率显著相关(B=1.01,Wald=16.29,P=0.00)。逻辑回归分析结果提示年龄、BMI、2PN率及ET胚胎数等对临床妊娠率均有影响,p<0.05。而移植胚胎的来源对临床妊娠率未产生影响,p>0.05。逻辑回归分析提示年龄、BMI、优胚率、ET胚胎数对活产率均有影响,p<0.05。而移植胚胎的来源并未对活产率产生影响,p>0.05。3.新鲜周期移植0PN和2PN卵裂期胚胎的移植结果比较0PN ET组患者(33.05±5.84)的年龄大于2PN ET组(31.36±5.09),差异有显著性,P<0.05;0PN ET组患者的年龄与0PN+2PN ET组(31.36±5.09)相比,无显著性差异,P>0.05。0PN ET组每周期的平均获卵数(6.49±4.43 VS9.57±4.94)、平均移植胚胎数(1.62±0.58 VS 2.03±0.44)、妊娠率(24.3%VS 46.4%)及植入率(17.0%VS 29.4%)均低于单纯移植2PN胚胎组,差异有显著性,P<0.05。0PN ET组的平均获卵数、平均移植胚胎数及临床妊娠率均低于0PN+2PN ET组(9.28±4.44,2.21±0.41,40.7%,22.3%),差异有显著性,P<0.05。0PN+2PN ET组的植入率低于2PN ET组(22.3%VS 29.4%),差异有显著性,P<0.05。4.复苏周期0PN和2PN囊胚的移植结果比较在囊胚的复苏周期中,0PN来源囊胚组与2PN来源囊胚组的年龄、内膜厚度及平均移植胚胎数均无显著性差异,P>0.05,提示两组具有可比性。前者与后者相比,临床妊娠率(66.7%VS 76.2%)、植入率(53.8%VS 54.4%)无显著性差异,P>0.05,0PN来源囊胚的流产率高于2PN组(17.6%VS 5.8%),差异有显著性,P<0.05。结论:1.IVF周期0PN胚胎的发生可能提示胚胎有较好的发育潜能。2.IVF来源的0PN囊胚与2PN囊胚有相似的临床妊娠率及活产率,但流产率高。3.囊胚培养可提高0PN来源胚胎的周期临床妊娠率。第二部分IVF周期1PN来源胚胎的临床移植价值研究研究目的:回顾性分析IVF周期中1PN来源胚胎产生的相关影响因素、1PN原核直径对胚胎质量的预测作用及移植1PN来源胚胎的临床治疗结局。研究方法:1.回顾性分析新鲜周期移植卵裂期胚胎临床治疗结局:收集2007年7月至2015年6月期间于郑州大学第三附属医院生殖医学中心实施常规新鲜周期IVF治疗的所有卵裂期胚胎资料。所有的女方患者均纳入。夫妇双方染色体核型分析均为正常。逻辑回归法分析1PN胚胎产生的可能相关因素。根据原核直径大小分为3组,比较3组的卵裂期胚胎质量及囊胚形成率。根据移植胚胎来源不同分为1PN ET组(20周期),1PN+2PN ET组(51周期)和2PN ET组(3750周期)。比较各组的年龄、平均获卵数、移植胚胎数、临床妊娠率、植入率。2.回顾性分析复苏周期移植囊胚的临床治疗结局:收集2014年1月至2015年6月期间于郑州大学第三附属医院生殖医学中心实施冷冻囊胚复苏周期的资料。根据移植囊胚的来源不同分为2PN组(1040周期)和1PN组(22周期)。比较两组的临床妊娠率、植入率。结果:1.回顾性分析了6434个IVF-ET周期。其中1PN来源的胚胎占所有卵裂期胚胎的7.5%(3916/51922)。2.1PN发生率的逻辑回归分析结果含有1PN胚胎的患者与无1PN胚胎的患者相比更年轻(30.79±5.25 VS33.03±6.22),具有更低的FSH水平(6.71±2.38 VS 7.74±3.94)、更高的获卵数(13.82±7.19 VS 8.32±5.88)和较低的2PN率(61.1%VS 66.6%),差异有显著性,P<0.05。两组的优质胚胎率、临床妊娠率、流产率及活产率均无显著性差异,P>0.05。对1PN发生率进行逻辑回归分析,结果提示患者的基础FSH、获卵数和2PN率与1PN的发生率显著相关(B=-0.130,Wald=0.212,P=0.045)。3.1PN与2PN卵裂期胚胎新鲜周期移植结果对比1PN ET组与2PN ET组相比,年龄与每周期平均获卵数均无显著性差异,P>0.05;平均移植胚胎数(1.20±0.42 VS 1.97±0.44)、临床妊娠率(10.0%VS51.7%)及植入率(8.3%VS 36.8%)相比,前者均低于后者,差异具有显著性,P<0.05;1PN ET组年龄、获卵数、平均移植胚胎数、妊娠率及植入率与1PN+2PN ET组相比,均无显著性差异,P>0.05。1PN+2PN ET与2PN ET相比,年龄较大(33.73±4.73 VS 31.23±7.22)、每周期获卵数较低(8.53±5.12 VS 10.03±5.13)、平均移植胚胎数较高(2.37±0.49 VS 1.97±0.44)、临床妊娠率(31.4%VS 51.7%)及植入率(21.5%VS 36.8%)较低,差异具有显著性,P<0.05。4.1PN与2PN囊胚在复苏周期的对比1PN来源囊胚组与2PN来源囊胚组的年龄、内膜厚度均无显著性差异,P>0.05。前者的平均移植胚胎数少于后者(1.09±0.23 VS 1.74±0.38),差异有显著性,P<0.05。1PN组的临床妊娠率(27.3%VS 76.2%)、植入率(25.0%VS 54.4%)低于2PN组,差异有显著性,P<0.05。1PN组移植22个周期,临床妊娠有6个周期,均未出现流产情况。5.1PN受精卵原核直径与胚胎质量之间的关系根据原核直径将1PN受精卵分为≥29μm组,26-28μm组和≤25μm组。≥29μm组与26-28μm组相比,6-8细胞比例(95.7%VS 66.7%),碎片<20%胚胎比例(82.6%VS 38.5%)及囊胚形成率(65.2%VS 27.8%),前者均高于后者,差异有显著性,P<0.05;≤25μm组的6-8细胞比例,碎片<20%胚胎比例及囊胚形成率分别为44.7%,45.8%,16.7%,与≥29μm组相比,差异具有显著性。26-28μm组与≤25μm组相比,前者6-8细胞比例及囊胚形成率均高于后者,差异有显著性,P<0.05。1PN胚胎总的囊胚形成率为25.3%(133/526)。结论:IVF来源的1PN卵裂期胚胎及囊胚发育潜能较差。第三部分利用二代测序技术检测IVF周期0PN及1PN来源囊胚的非整倍性的研究研究目的:比较0PN、1PN及2PN来源胚胎的囊胚形成率。通过二代测序技术检测0PN、1PN来源的囊胚的非整倍体率,与2PN来源的囊胚的非整倍体率比较,从遗传学角度来分析0PN、1PN来源囊胚的临床应用价值。研究方法:1.收集2015年1月至8月期间于我中心实施常规IVF周期的所有0PN、1PN来源的胚胎,将其培养至囊胚期。对照组为同期2PN来源胚胎。患者纳入标准:女方年龄≤35岁。夫妇双方染色体核型分析均为正常。比较0PN、1PN和2PN来源胚胎的囊胚形成率。2.选取与2PN组女方年龄相匹配的0PN、1PN来源的囊胚各15枚进行活检,并利用二代测序技术检测染色体非整倍体率;2PN组囊胚的二代测序结果来自于郑州大学第三附属医院生殖中心PGD预实验,共10枚做为对照组。比较0PN、1PN和2PN来源囊胚的染色体非整倍体率。结果:2PN、1PN及0PN的囊胚形成率分别是52%,25.3%和47.9%。0PN、1PN的囊胚形成率与2PN相比,差异均具有显著性,P<0.05。0PN与1PN的囊胚形成率相比,差异也具有显著性,P<0.05。2PN、1PN及0PN来源囊胚的染色体非整倍体率分别为22.2%,66.7%,40%。0PN与2PN相比差异无显著性,1PN与2PN相比,染色体非整倍体率显著性降低,P<0.05。结论:1.IVF来源的0PN囊胚具有和2PN来源胚胎相似的染色体非整倍体率。2.IVF来源的1PN囊胚染色体非整倍体率较高。