绝经后骨质疏松症（Postmenopausal Osteoporosis,PMO）是人类衰老过程中的一种常见多发病,主要是由于妇女绝经后卵巢功能衰退,雌激素分泌降低,引起骨代谢异常,导致的严重骨丢失疾病。PMO的常见口腔并发症为慢性牙周炎,相关研究证明,机体的雌激素水平不仅对全身的骨代谢产生影响,而且也直接影响牙周局部的功能和代谢^[1,2]。多年来,临床上治疗PMO的首选治疗手段为雌激素替代治疗,能显著改善妇女的生活质量,尤其对抑制骨吸收有一定作用,但其长期使用可致患者罹患乳腺及生殖系统肿瘤风险增加^[3]。研究表明,颌骨骨髓内的间充质干细胞（BMSCs）可经过血管通道进入牙周组织,分化为牙周前体细胞并参与牙周组织的再生^[4]。对于绝经后骨质疏松骨髓间充质干细胞（PMO-BMSCs）^[5]相关研究证实,其骨向分化能力出现明显下降,且诱导成骨过程中细胞凋亡增加,这可能是引起骨质疏松及牙周骨组织缺损的重要原因。Mamalis等人研究发现,雌激素及其受体（ER）主要通过调控Periostin（骨膜蛋白）的表达来参与牙周组织的代谢和功能改建^[6]。大量研究证实,Periostin还能够通过介导整合素依赖的细胞增殖、粘附和运动,保护细胞降低低氧引起的细胞损伤,并抑制细胞凋亡。然而,Periostin表达上调能否改善PMO-BMSCs的生物学功能,改善局部微环境,提高BMSCs的存活率,未见相关报道。为此,本实验拟借助慢病毒载体系统,将携带Periostin目的基因的慢病毒转染PMO-BMSCs,通过上调Periostin的表达,初步探讨Periostin对PMO-BMSCs的生理功能的调节作用,从而为伴有绝经后骨质疏松牙周病的干细胞治疗提供更多的理论基础。研究内容:1.大鼠绝经后骨质疏松模型的建立与评估雌性SD大鼠随机分为两组,对去势组（OVX组）大鼠采用改良背部单切口切除双侧卵巢建立大鼠骨质疏松模型,而假手术组（SHAM）组也采取相同手术入路,但仅切除卵巢周围等量脂肪组织。术后每周对两组大鼠进行体重记录,建模三个月后,1%戊巴比妥钠腹腔注射麻药过量处死大鼠,取股骨进行Micro-CT扫描,三维重建后评估建模是否成功,并对相关骨形态学参数进行分析。2.BMSCs的分离、培养与鉴定建模成功后,无菌条件下提取两组大鼠骨髓,使用全骨髓贴壁法进行骨髓间充质干细胞的分离培养,随后使用流式细胞术进行干细胞表面免疫标记物检测,成骨成脂诱导鉴定干细胞分化特性。3.重组慢病毒（pGC-Fu-POSTN）转染BMSCs（OVX-Virus）利用含有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和大鼠Periostin基因的重组慢病毒（pGC-Fu-POSTN）转染OVX组BMSCs,感染预实验确定慢病毒感染BMSCs的复感染指数（MOI）和最佳感染条件。取第三代OVX组BMSCs,根据预实验结果进行正式转染,感染约72小时后,荧光表达丰度较高时,用荧光显微镜观察感染效率,并进行后续实验（OVX-Virus组）。4.Periostin上调对OVX-BMSCs的作用以第三代OVX组和SHAM组细胞作为两组对照组,病毒转染第4天OVX-Virus组细胞作为实验组。CCK8法检测三组细胞的增殖能力;成骨诱导后,ALP染色、茜素红染色鉴定三组细胞成骨能力;流式细胞仪检测三组细胞的细胞周期和细胞凋亡;提取细胞内总RNA,实时定量PCR（RT-PCR）检测成骨相关基因;提取细胞内总蛋白,蛋白印迹法（Western Blot）检测三组细胞成骨相关蛋白含量。研究结果:1.构建大鼠模型后,每周对两组大鼠进行称重记录,可见去势组大鼠的体重增长趋势明显高于假手术组;建模三个月后,麻药过量处死大鼠,取股骨进行Micro-CT扫描,扫描结果显示,OVX组松质骨骨小梁数目明显减少,密度降低,松质骨内间隙增宽,两组大鼠骨形态学参数分析可见,骨体积分数、骨小梁厚度均有显著性差异。以上所有结果说明雌性去势大鼠骨质疏松模型建模成功。2.使用全骨髓贴壁法对BMSCs进行分离培养,传代培养后,显微镜下形态学观察可见骨髓间充质干细胞形态逐渐均一,以三角形或多边形为主,呈“旋涡状”排列;流式细胞术干细胞表面标志物检测结果显示,实验所提取细胞表面高表达CD29和CD90,很少甚至不表达CD34和CD45,符合骨髓间充质干细胞表面免疫学特征;成骨成脂诱导后,有钙结节和脂滴形成。以上结果说明实验成功提取了BMSCs.3.根据慢病毒转染感染条件及MOI的选择原则,预实验结果确定本实验所用BMSCs的MOI=70,感染条件为常规培养基+Polybrene,感染后8h换回常规培养基继续培养。感染约72h后,荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白（EGFP）绿色荧光的表达,感染效率80%左右,且细胞生长良好,表明携带目的基因的慢病毒成功转染了宿主细胞,可做后续实验检测。4.病毒转染后碱性磷酸酶活性增强,染色加深,茜素红染色钙化结节数目较OVX组增多,茜素红定量分析后其差异具有统计学意义;CCK8细胞增殖检测OVX组BMSC增殖速率较假手术组降低,而Periostin上调后BMSCs增殖速率有所升高;流式细胞仪检测细胞周期可见OVX-Virus组BMSCs的S期细胞比例显著高于OVX组（P<0.05）;流式细胞仪检测细胞凋亡率可见OVX-Virus组BMSCs的细胞凋亡率显著低于OVX组（P<0.05）;RT-PCR检测成骨相关基因ALP、BSP、COL1、Periostin可见,病毒转染后均较去势组有所上调（P<0.05）;Western Blot检测成骨相关蛋白也证明ALP、BSP、COL1、Periostin表达量均有所提升（P<0.05）。研究结论:1.采用改良背部单切口切除双侧卵巢建立大鼠骨质疏松模型,体重监测及术后3个月Micro-CT扫描证实绝经后骨质疏松模型建造成功。2.利用含有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和大鼠Periostin基因的重组慢病毒转染OVX组BMSCs,荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白（EGFP）绿色荧光成功表达,且细胞生长状态良好,表明携带目的基因的慢病毒成功转染了宿主细胞。3.Periostin表达上调可提高去势骨髓间充质干细胞的成骨分化及细胞增殖能力,并对其凋亡有抑制作用。