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基因疗法是治疗肝癌的一种新途径，其中自杀基因疗法最具潜力，自杀基因单纯疱疹病毒胸腺嘧啶脱氧核苷酸(herpes simplex virus thymidine kinase,HSV-TK)被广泛研究，但是单基因作用效果有限。肿瘤抑素(tumstatin)是目前为止发现的活性最强的内源性血管抑制因子，它除了具有显著的抗肿瘤血管生成作用，还具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。研究证实人端粒酶逆转录酶(humantelomerase reverse transcriptase, hTERT)仅在端粒酶阳性的肿瘤细胞中表达，其启动子发挥核心作用，因此利用hTERT启动子驱动TK基因和tumstatin基因，二者“双管齐下”，可作为一种治疗肝癌的新思路。目的：构建重组慢病毒Lv-hTERTp-TK/GCV与Lv-hTERTp-tumstatin，观察二者在人肝癌HepG2细胞中的特异表达，以及二者联合对HepG2细胞增殖和凋亡的影响。方法：1.体外培养人肝癌细胞HepG2，人正常肝细胞L-02以及293T细胞；2.构建重组慢病毒Lv-hTERTp-TK/GCV，Lv-hTERTp-tumstatin以及慢病毒空载体Lv-hTERTp-eGFP；3.分别瞬时转染HepG2和L-02细胞；4.荧光显微镜检测HepG2，L-02细胞中eGFP/mCherry的表达；5.逆转录PCR检测TK，tumstatin在HepG2和L-02细胞中的表达；6. MTT法检测转染后各组HepG2，L-02细胞的增殖情况；7.流式细胞术检测转染后各组HepG2，L-02细胞的凋亡情况；8.RT-PCR，Western blot分别检测转染后HepG2细胞bcl-2，VEGF mRNA和蛋白的表达。结果：1.成功构建了重组慢病毒Lv-hTERTp-TK/GCV，Lv-hTERTp-tumstatin和Lv-hTERTp-eGFP（空载体阴性对照）；2.转染后TK，tumstatin基因在HepG2细胞中特异表达，在L-02细胞中无表达；3. TK组，tumstatin组以及联合组均对HepG2细胞生长有抑制作用，联合组抑制率明显高于单基因作用组(F=731.679, P<0.05)，各组L-02细胞抑制率差异无统计学意义(F=0.774,P>0.05)；4.联合组HepG2细胞总凋亡率达(72.61±3.29)%，明显高于TK组(53.63±3.06)%，tumstatin组(45.13±2.15)%，空白对照组(13.29±1.15)%(F=365.022,P<0.05)，各组L-02细胞凋亡率差异无统计学意义(F=0.391, P>0.05)；5.与对照组相比，实验组HepG2细胞bcl-2及VEGF表达水平均下降(bcl-2mRNA:F=322.780, P<0.05, VEGF mRNA: F=629.534, P<0.05, bcl-2蛋白: F=34.203,P<0.05, VEGF蛋白: F=32.988, P<0.05)，其中联合组bcl-2及VEGF表达水平均低于单基因组(P值均<0.05)。结论：重组慢病毒Lv-hTERTp-TK/GCV，Lv-hTERTp-tumstatin构建成功，并且能有效转染人肝癌HepG2细胞。hTERT启动子驱动TK，tumstatin基因在肝癌HepG2细胞中靶向表达。两种基因联合与单基因作用相比能显著抑制肝癌HepG2细胞增殖和促进肝癌HepG2细胞凋亡，其机制可能与bcl-2及VEGF表达下调有关。