论文部分内容阅读
目的：胃癌是世界最常见的恶性肿瘤之一，死亡率高，居消化系统恶性肿瘤首位。本实验室前期发现ZNF139的异常表达与胃癌的发生发展、侵袭转移、增殖凋亡等密切相关，本实验以胃癌SGC7901细胞原位移裸鼠模型为对象，通过荧光双向差异凝胶电泳（2D-DIGE）结合液质联用（LC-MS）等蛋白质组学技术研究抑制ZNF139对胃癌的原发灶和转移灶的影响，为ZNF139参与胃癌转移调控机制提供依据。方法：1合成针对ZNF139的小干扰RNA（siRNA-ZNF139），以siRNA-ZNF139质粒对胃癌细胞系SGC7901（中分化腺癌）进行转染，转染完成后用G418筛选。体外培养对数生长期SGC7901细胞，以siRNA-ZNF139质粒对其进行干扰，qRT-PCR检测不同浓度siRNA-ZNF139干扰质粒抑制率，使用G418对干扰后细胞株进行筛选，得到最适浓度干扰细胞系。2建立人胃癌原位移植裸鼠模型体外收集经G418筛选siRNA-ZNF139质粒转染胃癌细胞、阴性质粒转染胃癌细胞及普通SGC-7901细胞，接种至裸鼠皮下,皮下瘤鼠间传代5次。将第六代皮下瘤剪成约1mm~3大小瘤块，用OB生物胶粘贴法进行裸鼠原位移植。成瘤后每4天测量原位瘤长短径，待直径约1.0cm左右时，脱颈处死裸鼠，取出原位移植瘤、腹腔肿大淋巴结。每个标本一分为三，两份迅速置液氮灌中保存，一份用福尔马林固定送病理检查。3应用荧光双向差异凝胶电泳（2D-DIGE）技术分别分离siRNA-ZNF139干扰前后胃原位移植瘤及腹腔转移淋巴结蛋白质，选定差异点后，用Ettan spot picker挖取，并行胶内酶解，应用液质联用（LC-MS）质谱鉴定技术对挖取的蛋白质点鉴定，并对鉴定出的蛋白质进行分析。4应用Western blot方法验证裸鼠原位移植瘤组织及腹腔转移淋巴结中差异蛋白质的表达，检测是否与蛋白质组学结果一致。结果：1siRNA-ZNF139质粒转染胃癌SGC7901细胞后ZNF139mRNA表达的变化qRT-PCR检测显示在0μg/μl、0.4μg/μl、0.6μg/μl、0.8μg/μl、1.0μg/μl重组质粒转染后的SGC7901细胞中ZNF139mRNA相对表达量分别为1.0020±0.0765，0.6788±0.1032，0.3691±0.0242，0.1711±0.0133，0.2880±0.0506，统计分析显示各组有显著差异(P<0.01)，其中以0.8μg/μl组抑制效率最高，为82.92%。2siRNA抑制ZNF139表达后裸鼠原位移植瘤的形态观察皮下移植瘤经6次鼠间传代后，待直径约1.0cm左右时取出，用OB生物胶粘贴法进行原位移植，一周后空白组和阴性组裸鼠均可触及腹部肿瘤，两周左右siRNA-ZNF139组裸鼠可触腹部移植瘤，之后瘤体不断增大。每4天测量其最长径与最短径，并按照V=ab~2/2（a为长径，b为短径）计算移植留瘤体积。空白组比阴性组原位移植瘤瘤略大，没有统计学差异（P>0.05），与阴性组及空白组比较，实验组原位移植瘤瘤生长明显减慢(P<0.05)。15只裸鼠原位移植瘤经HE染色组织病理学检查均证实为胃癌，原位成瘤率100%。3siRNA抑制ZNF139对裸鼠腹腔转移淋巴结生长的影响空白组、阴性组及实验组裸鼠腹腔均可见肿大淋巴结，每组各取5枚阳性淋巴结，其中空白组腹腔淋巴结转移率36.67%，阴性组腹腔淋巴结转移率63.33%，实验组腹腔淋巴结转移率为66.67%。空白组与阴性组比较，腹腔淋巴结转移数差异没有统计学意义(P>0.05)，与空白组及阴性组相比较，实验组腹腔淋巴结转移数明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。4蛋白质样品完整性的检测提取原位移植瘤及腹腔转移淋巴结蛋白质，SDS-PAGE分离后考马斯亮蓝染色显示，原位移植瘤蛋白及转移淋巴结蛋白无明显降解，蛋白质完整性良好，实验组和对照组蛋白质在PAGE上差别不明显。52D-DIGE和LC-MS结果原位移植瘤2D-DIGE图谱上蛋白质点为7658±47个，匹配率为91.6%，转移淋巴结2D-DIGE图谱上蛋白质点为3117±82，匹配率为92.5%，说明双向电泳技术具有较高的重复性。应用DeCyder DifferentialAnalysis Software在原位移植瘤中选取9个差异明显的蛋白点，并用Ettanspot picker系统进行挖点。经LC-MS鉴定出出5种蛋白质（Fascin、ANXA1、hnRNPA2/B1、glutamine synthetase、carbonic anhydrase3），筛选后经功能分析确定3种可能与胃癌有关的蛋白质即Fascin、ANXA1、hnRNPA2/B1，其中Fascin、hnRNPA2/B1在siRNA-ZNF139组的胃癌组织中表达下调,ANXA1表达上调。在转移淋巴结选取5个差异蛋白点，经LC-MS鉴定出3种蛋白质（trypsin-1、desmin、ANXA5），经功能分析确定1种可能与胃癌有关的蛋白质即ANXA5，ANXA5在siRNA-ZNF139组的胃癌组织中表达下调。6应用Western blot法对各实验裸鼠原位移植瘤组织中Fascin、ANXA1、hnRNPA2/B1及转移淋巴结中ANXA5分别和ZNF139的表达进行了验证。统计学分析表明，与对照组相比，原位移植瘤中siRNA-ZNF139组的Fascin、hnRNPA2/B1、ZNF139表达量显著降低，而ANXA1表达量明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。在腹腔淋巴结中与对照组相比siRNA-ZNF139组ANXA5表达量显著降低，差异有统计学意义(P<0.01),与蛋白质组学结果一致。结论：1人胃癌裸鼠原位移植模型可近似模拟人胃癌在体内的增殖、侵袭、转移等生物学行。建立操作简单且成瘤率高，是目前较理想的研究胃癌的实验手段。22D-DIGE对每个蛋白质点都可以进行统计学分析，保证所检测到的蛋白精确、可靠，重复性良好。与液质联用（LC-MS）技术结合能对差异蛋白质进行鉴定。3ZNF139作为转录水平的调控因子，在胃癌中的表达可能通过促进Fascin、hnRNPA2/B1和抑制ANXA1的表达来促进肿瘤的侵袭转移，进而说明ZNF139可能直接或间接参与胃癌的增殖、凋亡、侵袭、转移等生物学行为。4ANXA5在siRNA-ZNF139组的腹腔淋巴结中表达下调，说明在胃癌在腹腔淋巴结转移过程中，ZNF139可能直接或间接与ANXA5相互作用，促进胃癌在淋巴结中侵袭、转移。