随着集约化养殖业的快速发展,有疾病防治和促进生长功能的抗生素类药物和重金属常作为饲料添加剂被广泛应用在畜禽医疗和养殖业中,其中以四环素类抗生素和重金属铜的使用量最多。抗生素的广泛使用和低效移除导致目前大量的抗生素持续输出到水环境中。近年来,抗生素药物在污水厂、地表水、地下水甚至饮用中都有检出。高浓度抗生素一方面会对水生生物产生毒害作用,威胁水生生态系统的安全,另一方面,抗生素的长期暴露会诱导生物体产生耐药性,并对人类健康安全造成威胁。目前水体环境中残存药物的环境风险是国际研究的热点。虽然抗生素的环境监测已有不少文献报道,但对于四环素类抗生素的环境效应及机制研究并不多。环境中重金属铜的浓度升高时,一方面会直接对水生生物产生毒性效应,另一方面,当抗生素同时存在时,还会增加环境中抗性基因的丰度和传播。目前对于四环素与铜的复合污染的环境效应所知不多。基于以上研究现状,本论文选取斑马鱼为模式生物,以四环素和重金属铜为研究对象,针对四环素、铜对斑马鱼胚胎的单一毒性效应及机制进行了研究,并对两者的复合污染做了初步探索。第一部分内容是应用急性暴露实验、AO染色、RT-PCR等生物学方法,研究了四环素的水生毒理效应。毒性效应方面,四环素的96h急性暴露实验结果表明四环素(2-20,000μg/L)对斑马鱼胚胎的存活率无明显影响,但四环素明显抑制了斑马鱼胚胎的生长发育(p<0.05),主要表现为孵化延迟、体长变短、卵黄囊肿胀和鱼鳔缺失等效应。经过分析得出四环素对斑马鱼胚胎96h的EC1o为3.16μg/L,低于实际环境浓度。在毒理机制研究方面,四环素暴露(10-200μg/L)导致幼鱼的SOD和CAT基因的表达量明显上调,并且斑马鱼幼鱼体内ROS含量明显上升(p<0.05),说明四环素对斑马鱼的早期发育产生了氧化损伤。AO染色结果表明四环素(5,10,201μg/L)导致斑马鱼幼鱼的尾部和心脏区域产生了细胞凋亡。细胞凋亡相关基因表达结果显示四环素对斑马鱼胚胎产生的细胞凋亡可能是由氧化应激导致的,因此推测Caspase细胞凋亡信号通路可能是四环素诱导斑马鱼早期发育产生细胞凋亡的主要信号通路。另外,ABCC基因和药物代谢基因(细胞色素p450)的表达结果显示四环素可以诱导斑马鱼胚胎产生耐药性。针对铜的水生毒理效应研究,本文运用了急性暴露实验(96h)来研究其对斑马鱼胚胎的毒性效应,结果显示,铜具有明显的致死和致畸效应,其对斑马鱼胚胎96h的LC1o为2.5 μg/L,EC1o为0.1μg/L。在表型效应方面,铜(2.56-256 gg/L)抑制了斑马鱼胚胎的生长发育,表现为延迟了斑马鱼胚胎的孵化、卵黄囊吸收、头部、鱼鳔和体长等生长指标的发育。在毒理机制的研究中,运用了ICP-MS、RT-PCR和AO染色三种方法,数据表明,斑马鱼对不同浓度铜的相对吸收率随着浓度的上升而下降,头部对铜的富集程度要比躯干部位更明显；RT-PCR数据表明,环境浓度的铜可能通过影响神经和心脏相关基因的表达引起斑马鱼胚胎的神经发育和心脏发育异常,但并未对MT基因产生显著性变化。AO染色结果显示铜导致斑马鱼幼鱼心脏区域产生了细胞凋亡,同时还有少量的凋亡细胞集中在幼鱼的尾部。最后一部分是对四环素和铜的复合污染的研究工作。首先,两者96h持续联合暴露的结果表明,与铜的单一毒性相比,在加入不同浓度的四环素(10-1000μg/L)后,存活率、孵化率、头部发育和卵黄囊营养吸收等指标在不同程度上都有所缓解(p<0.05)。ICP-MS的数据表明,四环素能明显降低斑马鱼幼鱼体内的总铜含量(p<0.05)。因此,我们推测两者相互作用形成络合物减少了斑马鱼胚胎吸收的铜含量,从而缓解了铜的毒性效应,这些结论表明了四环素和铜之间的复合污染类型属于拮抗作用。综合以上论述,本论文的研究结果表明,四环素对斑马鱼胚胎具有发育毒性,可以明显抑制胚胎的生长发育。四环素对斑马鱼胚胎的毒性机制可能是通过形成ROS,对机体产生氧化损伤,氧化损伤进一步导致幼鱼产生细胞凋亡,进而抑制斑马鱼胚胎的生长发育。环境浓度的铜可能通过细胞凋亡、分子层面的变化等方式对斑马鱼的早期生长发育产生危害,如延迟生长发育和影响神经和心脏发育,另外铜可通过和四环素等环境中其他污染物的结合降低铜离子的生物有效性和毒性。所有的这些数据和结论可以为抗生素和重金属的生态风险评价以及环境标准的制定提供一定的科学依据。