甲状腺激素通过与广泛分布在各种组织中的甲状腺激素受体(thyroidhormone receptors,TRs)结合,作用于转录过程实现其对靶基因的正性/负性调节,对于机体的正常分化发育和代谢平衡具有十分重要的作用。TRα和TRβ基因产生的转录本(transcript)因选择性剪接或转录起始位置的不同而产生若干同功体(isoform)。TRβ△是继已报告过的大鼠TRs: TRα1、TRα2、TRα3、TR△α1、TR△α2、TRβ1、TRβ2、TRβ3和TR△β3后我们新发现的一种甲状腺激素受体亚型。其mRNA仅较TRβ1的mRNA多出了一个108bp的片段。TRβ△蛋白亦与TRβ1具有较高同源性,仅在近氨基端多出了36个氨基酸。目前尚无针对此新受体蛋白的特异性抗体,而文献报道中关于TRβ1的组织分布研究尚无法区分TRβ1和TRβ△两种受体。因此,本文针对此TRβ△新亚型在大鼠各组织中的分布状况进行研究。实验目的:自行制备抗TRβ△多克隆抗体,检测成年大鼠不同组织中TRβ△蛋白的表达状况。Real-time PCR检测TRβ△转录本在大鼠不同组织中的含量。分析TRβ△、TRβ1在转录水平表达的时间、空间特异性及两者的表达相关性。方法:1.对TRβ△的特异片段进行生物信息学分析,以确定其含有抗原决定簇,适合作为人工抗原用于免疫过程。建立间接ELISA用以在免疫过程中监测抗血清效价并评价纯化后抗体效价。表达重组大鼠TRβ△和TRβ1蛋白用以进行多抗的特异性检测。2.应用RT-PCR方法检测正常成年大鼠肝、脑、肾、脾、小肠、骨组织中是否存在TRβ△的表达。用Real-time实时荧光定量PCR分析TRβ△、TRβ1及TRβ△+TRβ1mRNA在成年大鼠肝、脑、肾、脾组织中的空间分布特异性,以及在幼鼠不同发育期的时间分布特异性。3.应用Western blot方法检测成年大鼠肝、脑、肾、脾组织中TRβ△蛋白的表达。结果:1. TRβ△特有的36AA片段中含有单一抗原决定簇。纯化后的抗血清仍具有较高效价,所制备抗体可特异性地与重组大鼠TRβ△蛋白发生免疫反应而不与重组大鼠TRβ1蛋白发生交叉反应。2.在正常成年大鼠肝、脑、肾、脾、小肠、骨组织均检测到TRβ△mRNA的表达。经对TRβ△、TRβ1及TRβ△+TRβ1三种mRNA的定量研究发现,TRβ△与TRβ1在成年大鼠的肝,肾,脾组织高表达,脑组织中低表达;不同发育期大鼠肝组织的表达强度均高于其它三种组织,脑组织并未表现出类似于成年大鼠的显著低水平表达。就表达的阶段特性而言,各组织的表达峰值均处于发育期,成年后表达水平降低。在不同组织中及不同发育时段,TRβ△的表达量均显著高于TRβ1,并在TRβ1 +TRβ△的和值中占相当大的比例。3.在成年大鼠肝、肾组织的核提取物中可检测到TRβ△蛋白的表达,但未能在脑、脾组织中检测到其表达。结论:1.成功制备了抗TRβ△多克隆抗体。所制备的抗体具有较高的效价及特异性。2. TRβ△mRNA在正常大鼠肝、脑、肾、脾、小肠、骨组织中普遍存在,并非是来源于个体基因突变的偶然现象。TRβ△与TRβ1均与原来认为的TRβ1(实际上是TRβ1 +TRβ△)有着非常相似的组织分布特征,TRβ△表达具有与其它TRβ亚型类似的在发育阶段高表达,成年后趋于较低水平稳定表达的特征。在大鼠组织中TRβ△新亚型可能作为一种主要的剪接形式而存在。3. TRβ△作为一个新的受体蛋白而存在于正常成年大鼠肝、肾组织中。