目的:探讨调节因子PhoP对伤寒沙门菌H:z66鞭毛抗原编码基因fljB:z66在各种环境应激下的表达调节作用。方法:1.采用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌phoP缺陷变异株。根据伤寒沙门菌phoP基因序列,设计PCR特异性引物,并在引物末端加上需要的酶切位点。扩增phoP基因上、下游片段,用BglⅡ消化后,定向连接成phoP基因的缺损性同源性核苷酸片段。将此片段胶回收后用后导入自杀质粒pGMB151的BamH I酶切位点,将阳性质粒用电击法导入伤寒沙门菌野生株(GIFU 10007),进行同源重组。用PCR观察重组现象,将完全重组的菌株作为phoP基因的缺陷变异株,并通过相应的核苷酸序列分析加以确定。2.将lacZ基因作为鞭毛抗原基因fljB的报告基因,采用自杀质粒介导的同源重组方法制备fljB∷lacZ变异株,使菌株的β-半乳糖苷酶活性代表fljB基因的蛋白表达水平。通过电击法将含fljB∷lacZ的重组质粒转入野生型及phoP~-伤寒沙门菌,通过在含X-Gal的蔗糖平板上的显色筛选和PCR筛选获得同源重组的fljB∷lacZ和phoP~-fljB∷lacZ变异株,并通过相应的核苷酸序列分析加以确定。3.对伤寒沙门菌的fljB∷lacZ和phoP~-fljB∷lacZ变异株同时进行高渗应激、氧应激、胆汁应激和弱酸应激,通过比较两者β-半乳糖苷酶活性的变化,研究在不同应激环境下调节因子PhoP是否对鞭毛抗原编码基因fljB:z66存在表达调节作用。结果:1.经PCR及序列分析证实变异株中phoP基因缺失了297个碱基,表明成功构建伤寒沙门菌phoP基因缺陷变异株。2.经PCR、X-gal底物显色及序列分析证实,变异株中fljB基因中的763bp被3550bp的lacZ片段替代,表明伤寒沙门菌fljB∷lacZ和phoP~-fljB∷lacZ变异株构建成功,可通过测定其β-半乳糖苷酶活性反映fljB翻译表达水平。3.对比伤寒沙门菌的fljB∷lacZ和phoP~-fljB∷lacZ变异株在高渗应激、氧应激、胆汁应激和弱酸应激下β-半乳糖苷酶活性变化的差异,结果显示,在低渗环境下,伤寒沙门菌的fljB∷lacZ变异株的β-半乳糖苷酶活性明显高于phoP~-fljB∷lacZ变异株;在高渗应激后,fljB∷lacZ株中β-半乳糖苷酶活性呈从高到低的抑制性变化,而phoP~-fljB∷lacZ株中的酶活性却无明显的动态变化。在氧应激、胆汁应激和弱酸应激时两者β-半乳糖苷酶活性变化无明显差异。结论:在低渗环境下,伤寒沙门菌调节因子PhoP促进了鞭毛抗原编码基因fljB:z66的表达;在高渗应激下,PhoP可能参与了鞭毛抗原编码基因fljB:z66的表达下调作用。