【目的】本研究通过对临床上牙周炎患者与健康患者牙龈组织中炎症细胞和自噬相关基因的表达的检测,初步分析自噬与炎症的相关性。然后构建大鼠牙周炎模型,通过药物抑制自噬,检测是否可以通过调节炎症激活的自噬来抑制炎症细胞的浸润以及牙槽骨的吸收,并在体外验证自噬调节对于破骨细胞的影响,以期能进一步揭示自噬在牙周炎炎症性骨吸收中的作用,为通过调控细胞自噬进行预防和治疗牙周炎提供新的思路。【方法】本研究包括了临床研究、体内实验和体外实验。在临床研究中,收集牙冠延长术中或开窗助萌术中切取的牙龈组织,作为健康牙龈组织;收集拔除无法保留重度牙周炎患牙时的牙龈组织,作为慢性牙周炎患者牙龈组织。再通过苏木精伊红染色、免疫组织化学染色等方法观察牙龈组织中炎症因子细胞以及自噬相关蛋白的表达情况。在体内实验中,我们通过建立大鼠牙周炎模型,同时进行牙龈局部注射自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)或氯喹(CQ)来进一步探究自噬在牙周炎炎症发生发展和骨代谢环节中的作用。实验动物随机分为以下6组:1)正常组;2)牙周炎组;3)牙周炎+低浓度3-甲基腺嘌呤组;4)牙周炎+高浓度3-甲基腺嘌呤组;5)牙周炎+低浓度氯喹组;6)牙周炎+高浓度氯喹组。给药21天后,通过Micro-CT评估牙槽骨丧失情况,通过组织学染色评估牙周炎症细胞浸润情况,通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察破骨细胞,并通过免疫组化染色法及蛋白质印迹法检测自噬相关基因和核转录因子的表达,包括酵母ATG6同源物(Beclin-1)、p62/SQSTM1、和微管相关蛋白1A/1B轻链3(LC3)、核因子-κB(NF-κB)和转录因子EB(TFEB)。破骨细胞是骨吸收过程中起主要作用的细胞,为了进一步分析自噬对OCs的影响,在体外实验中,我们提取了小鼠骨髓来源的单核巨噬细胞,并使用巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κB受体活化因子配体(RANKL)诱导培养其分化为破骨前体细胞。然后根据不同的处理方式,将诱导出的破骨前体细胞分为以下6组:1)正常组;2)脂多糖(LPS)组;3)3-甲基腺嘌呤组;4)3-甲基腺嘌呤+脂多糖组;5)氯喹组;6)氯喹+脂多糖组。通过TRAP染色观察破骨细胞数量,利用蛋白质免疫印迹检测自噬相关蛋白及共聚焦荧光显微镜观察绿色荧光蛋白标记的LC3(GFP-LC3)斑点的方法判断细胞自噬状态。【结果】在对健康人和慢性牙周炎患者的牙龈组织进行的检测中发现,牙周炎患者牙龈组织中炎性细胞浸润较健康组明显增多,且自噬相关蛋白LC3和p62的表达明显升高,即牙周炎组细胞自噬水平较健康组明显升高。在体内实验中,我们成功建立了大鼠牙周炎模型。给药21天后,Micro-CT结果显示3-甲基腺嘌呤和氯喹抑制了骨吸收,主要表现为釉牙骨质界到牙槽嵴顶(CEJ-ABC)的距离降低,CEJ-ABC测量的结果显示:高浓度氯喹组与牙周炎组的CEJ-ABC距离有显著统计学差异,其余组距离亦有降低但与牙周炎组无明显统计学差异,且抑制剂各组间差异不明显。除此之外,我们还利用TRAP染色观察到牙周炎组中吸收的牙槽骨边缘有大量破骨细胞浸润,而在自噬抑制剂组破骨细胞数量减少,由此我们猜测自噬抑制剂可能通过抑制破骨细胞的形成而减少牙槽骨的吸收。此外,免疫组化及蛋白印迹检测结果显示牙周炎组炎症细胞浸润明显,自噬相关蛋白Beclin-1、LC3明显升高,p62降低;而自噬抑制剂组的炎症细胞数量及NF-κB表达明显减少,且Beclin-1、LC3明显降低,而p62明显升高。在体外,我们通过骨髓单核巨噬细胞诱导法成功培养了破骨前体细胞。适量的炎症刺激物LPS处理能够促进破骨前体细胞稳定的向成熟的破骨细胞分化,而自噬抑制剂减少了LPS刺激的破骨细胞的形成。另外,通过腺病毒转染GFP-LC3,可以发现LPS刺激的破骨细胞内产生大量绿色斑点,而在自噬抑制剂组则观察到绿色荧光在胞质内表现为弥散状态,提示自噬参与了LPS刺激诱发破骨细胞形成的过程。【结论】本研究证实了自噬与牙周炎有一定关联。并且证明了自噬水平在牙周炎组织细胞中明显升高,而自噬抑制剂能通过自噬途径减少炎症细胞的浸润以及减少破骨细胞的数量从而减少牙槽骨吸收。另外,在体外实验中,我们进一步证明了自噬抑制剂对OCs的形成有直接的影响。因此,我们认为在牙周炎的发生发展中伴随着自噬对该过程的调节,通过自噬抑制剂下调炎症刺激所引起的高表达状态的自噬水平有利于促进细胞自噬的稳态,进而减缓牙周炎的炎症性骨破坏。