研究表明药用植物的抗病性以及药材品质的形成除了与外部环境有关外,还与内在的微生物环境密切相关。内生真菌作为药用植物体内重要的微生物成员之一,在与宿主植物长期共进化的过程中形成了独特的生物学特性和遗传物质,能与其建立良好的共生关系,就如同宿主的“肠道菌群”,对药用植物的生长、代谢、抗病性和品质的形成产生重要影响。本课题以我国重要药用植物开唇兰属(Anoectochilus)和血叶兰属(Ludisia)植物中分离得到的内生真菌为研究对象,以金线莲(Anoectocilus(Wall.)Lindl.)组培苗为研究平台,一方面筛选得到能够与金线莲共培养并对宿主生长有促进作用的活性菌株;另一方面,筛选得到对金线莲茎腐病具有拮抗作用的活性菌。利用HPLC和分光光度法研究活性菌对金线莲次生代谢的作用;通过免疫荧光染色验证金线莲内生真菌对宿主的成功侵染;通过形态及分子系统发育分析鉴定活性菌;通过qRT-RCR技术研究与金线莲生长相关基因的变化;通过转录组学研究抗病菌株对金线莲组培苗转录水平的影响。初步明确内生真菌对金线莲的有益影响及其可能的分子机制,为更好地揭示内生真菌对药材品质的影响及机制提供实验依据,也为后期将内生真菌来源的生物菌肥应用到人工栽培中,改良栽培金线莲的品质探索一条新途径。主要研究结果如下:1、采用传统分离法从兰科5种开唇兰属和1种血叶兰属植物中分离得到277株内生真菌,通过与模式植物拟南芥共培养初步筛选得到53株促进拟南芥生长的菌株,其中2株能够与金线莲组培苗共培养并显著提高宿主生物量,通过形态和分子鉴定分别为球毛壳菌Chaetomium globosum J162 和胶孢炭疽菌 Colletotrichum gloeosporioides J211;通过琼脂扩散法筛选得到49株拮抗尖孢镰刀菌的抗病菌,其中2株显著提高金线莲组培苗抗病性分别为球毛壳菌Chaetomium globosum J9和壳皮炭疽菌Colletotrichum crassipes J246。2、将初筛得到的53株促生菌打孔接种至金线莲组培苗中央位置进行共培养,考察活性菌对金线莲生长和次生代谢的影响。结果表明金线莲与活性菌共培养30天后,J162和J211均显著提高了宿主生物量;对金线莲活性成分包括黄酮类、金线莲苷和多糖含量有不同程度的促进作用;同时抗病相关酶包括β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶和超氧化物歧化酶活性均显著提高。3、将琼脂扩散法筛选得到的49株内生真菌和尖孢镰刀菌分别制成菌块后接种至金线莲组培苗中,使金线莲与各活性菌及致病菌共培养,考察在正常、致病菌胁迫条件下,活性菌株对宿主抗病性、生长、代谢的影响规律。结果表明J9和J246能够增强金线莲抗病性并缓解致病菌胁迫下对宿主生长的影响。利用UPLC和HPLC分析金线莲代谢产物积累的变化,检测得到黄酮类成分包括芦丁、异槲皮苷、水仙苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷和槲皮素的含量均有显著上升,金线莲特异性成分金线莲苷的含量也有不同程度的提高,另外苯酚-硫酸法检测发现J246促进植物多糖的积累;利用分光光度法测定各组金线莲β-1,3-葡聚糖酶、超氧化物歧化酶和过氧化物酶三种抗病相关酶的活性,结果得到同时接种活性菌和致病菌的植物体内酶活最高,尤其J9能够显著提高防御酶的活性,增强宿主抗病能力。该研究明确了 J9和J246对金线莲的生长、代谢及抗病性具有重要影响。4、通过对金线莲根部组织免疫荧光染色,在显微下观察到接种活性菌后新鲜金线莲根组织中内生真菌的侵染情况,发现其主要侵染部位是木质部薄壁细胞的细胞间隙,证明接种的活性菌成功侵染宿主植物并与其建立了和谐的共生体系,为后期研究内生真菌对宿主的侵染途径提供了一定的实验基础。5、分别通过qRT-PCR和转录组测序的研究手段探讨活性菌对金线莲生长和抗病的作用机制。qRT-RCR结果表明,与金线莲生长相关基因包括尿磷酸核苷转移酶(UPRT)、氨基酸跨膜转运子(AATMT)和编码突变酶K(matK)的表达在与J162共培养的苗中均被显著诱导提高,而J211共培养的苗中UPRT和AATMT的表达被提高,matK被抑制。运用转录组学手段对病原菌胁迫下抗病菌J9和J246处理后的金线莲组培苗在转录水平的变化规律进行了分析。通过测序和组装最终得到82515个unigene,平均长度为463bp,建立金线莲功能基因数据库。通过公共数据库的比对注释得到有63090个unigene至少能注释到一个数据库,基本覆盖了植物主要的生命活动过程;对各处理下转录组的差异表达进行分析,发现J9和J246能够调节甚至逆转致病菌F.oxysporum胁迫下某些基因的表达。