天然免疫系统主要通过模式识别受体识别病毒的入侵,进而产生一系列的细胞因子来抵抗病毒的入侵。RIG-I(Retinoic acid-inducible gene-I)样受体(RLRs),是机体识别RNA病毒的主要天然识别受体,包括RIG-I或MDA5,其在识别RNA病毒的核酸后,通过其C末端解螺旋酶结构域结合RNA,随后构象发生改变并募集至线粒体附近,通过与线粒体外膜上的线粒体抗病毒信号蛋白MAVS(mitochondrial antiviral signaling)相互结合,从而激活下游信号级联反应。MAVS的下游信号转导最终激活转录因子IRF3(interferon-regulatory factor 3)和NF-κB(nuclear factor kappa B),活化的IRF3和NF-κB入核,并结合至IFN-β的启动子区域,诱导IFN-β的表达,最终通过诱导干扰素刺激基因(IFN-stimulated genes,ISGs)的表达发挥抗病毒作用。在本课题中,我们利用全基因组CRISPR/Cas9文库来筛选影响VSV复制的宿主因子。通过对二代测序的结果进行分析,我们挑选并验证了对VSV复制影响较大的基因SLC25A23。SLC25A23是钙离子依赖的线粒体溶质载体,SLC25A23可以和Ca2+单向运输体MCU相互作用,充当ATP-Mg/Pi交换器,介导Mg-ATP转运以交换磷酸盐,催化腺嘌呤核苷酸进入或离开线粒体。我们在Hela-cas9细胞中用si RNA下调SLC25A23后,发现VSV的复制明显减少。在利用CRISPR/Cas9系统下调SLC25A23的Hela细胞系中,也得到了类似的结果。Ⅰ型干扰素信号通路介导的抗病毒功能在细胞抗病毒固有免疫中发挥了广泛而重要的作用。因此,我们检测了I型干扰素的产生,发现下调SLC25A23后,SEV刺激产生的IFN-β明显增加。接下来,我们在STAT1缺陷的细胞系U3A中,用si RNA下调SLC25A23,发现VSV的复制无明显差异。我们猜想SLC25A23在I型干扰素途径中发挥重要的作用。通过把SLC25A23的过表达质粒以及IFN-β-luc,RL-TK双荧光素酶报告质粒分别和RIG-IN,MDA5,MAVS,TBK1,IKKε,IRF3/5D等过表达质粒共转HEK293T细胞,然后用双荧光素酶报告系统检测IFN-β的变化,我们发现过表达SLC25A23对RIG-IN,MDA5,MAVS,TBK1,IKKε等接头分子所介导的IFN-β有明显的抑制作用,而对IRF3/5D所介导的IFN-β的产生没有影响,这提示我们SLC25A23作用于IRF3的上游分子。接下来,我们通过免疫共沉淀实验,发现SLC25A23可以和I型干扰素途径上游的MAVS和TBK1相互作用。MAVS是RLR信号通路中的关键接头分子,已有研究表明,RNA病毒感染机体后可引起MAVS构象发生变化,形成朊蛋白样聚集体。MAVS朊蛋白样聚集体的形成对RLR信号通路的活化起到关键作用。SLC25A23定位于线粒体上,我们猜测SLC25A23可能是通过调控MAVS所介导的I型干扰素的生成来调控天然免疫抗病毒反应。综上所述,我们利用全基因组CRISPR/Cas9文库来筛选影响VSV复制的宿主因子,尽管以前有过si RNA的全基因组筛选,但是通过对比我们发现了若干个影响VSV复制且未曾报道的基因。我们首次发现了SLC25A23在RNA病毒介导的天然免疫信号转导中发挥的重要的调控作用。此外我们还发现SLC25A23可以靶向MAVS和TBK1负向调控IFN-β的产生,发挥抗病毒作用。这个发现为临床治疗病毒感染性疾病提供了新的思路和治疗靶点。