论文部分内容阅读
[目的]1.研究TNFAIP3基因在SLE患者和正常人外周血总淋巴细胞和B淋巴细胞中的表达情况;2.研究在SLE患者和正常人外周血B淋巴细胞中过表达TNFAIP3基因的情况下,检测该基因对B淋巴细胞成熟分化相关的表面受体BAFF、Blimp-1和对TLR7/TLR9-NF-κB信号通路及下游信号分子IRF7的影响;3.研究在SLE患者和正常人外周血B淋巴细胞中沉默TNFAIP3基因的情况下,检测该基因对B淋巴细胞成熟分化相关的表面受体BAFF、Blimp-1和对TLR7/TLR9-NF-κB信号通路及下游信号分子IRF7的影响;4.通过本课题实验研究探讨TNFAIP3基因在SLE患者B淋巴细胞中潜在的作用机制及其临床意义,为TNFAIP3基因相关的分子信号途径在SLE疾病的发病和疾病活动过程中的作用提供了新的线索,同时也为疾病的治疗提供新的思路。[方法]1.收集SLE患者血液45例及正常对照血液35例,采用人外周血淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离出外周血总淋巴细胞,免疫磁珠分选CD19+B淋巴细胞;然后将分离的细胞进行RNA提取、反转录为cDNA;最后应用qRT-PCR技术检测外周血总淋巴细胞及B淋巴细胞中TNFAIP3 mRNA表达情况;2.构建含TNFAIP3基因的逆转录病毒表达载体TNFAIP3-pBABEpuro,选用293T细胞进行病毒包装,收集富含病毒颗粒的细胞培养上清,并加入预先分选出来的CD19+B细胞中,感染48h后收集细胞。运用qRT-PCR技术检测过表达的B细胞中TNFAIP3 mRNA、B细胞成熟分化相关的表面受体BAFF mRNA、Blimp-1 mRNA 以及 TLR7 mRNA、TLR9 mRNA 和下游信号分子 IRF7 mRNA的表达水平;3.将筛选出来的干扰效率较强的TNFAIP3-shRNA片段进行慢病毒包装,收集细胞培养上清,感染SLE患者及正常人CD19+B细胞,感染48h后收集细胞。同样运用qRT-PCR技术检测RNA干扰后的B细胞中TNFAIP3 mRNA、B AFF mRNA、Blimp-1 mRNA 以及 TLR7 mRNA、TLR9 mRNA和下游信号分子IRF7 mRNA的表达水平。[结果]1.SLE患者外周血总淋巴细胞和B淋巴细胞中TNFAIP3 mRNA的表达水平均低于正常人组,差异具有显著性(P<0.01);2.成功构建了含TNFAIP3基因的重组表达载体,并证实了其能在哺乳动物细胞中良好表达;3.分别在SLE患者及正常人B细胞中过表达TNFAIP3基因,过表达质粒感染组(TNFAIP3-pEZ-Lv201)的TNFAIP3mRNA表达水平均明显高于自身的对照组(pEZ-Lv201),且具有显著性的差异(P<0.01)。在正常人和SLE患者的B细胞中,过表达质粒感染组BAFF和Blimp-1 mRNA的表达水平都明显低于自身对照组,具有显著性的差异(P<0.01),且过表达质粒感染组TLR7、TLR9mRNA和TRAF6泛素化密切相关的下游信号分子IRF7 mRNA的表达水平均明显低于自身对照组,差异具有显著性(P<0.01);4.有效沉默SLE患者和正常人B细胞中TNFAIP3基因,均导致TNFAIP3 mRNA的表达明显下调,而干扰B细胞中TNFAIP3基因均导致B细胞中BAFF和Blimp-1 mRNA的表达较其对照组明显增高,差异显著(P<0.01)。而沉默组TLR7、TLR9和IRF7 mRNA的表达水平都明显高于对照组,且差异具有显著性(P<0.01)。[结论]1.TNFAIP3基因的异常表达提示该基因通过调节B细胞的成熟和分化可能是SLE的发病机制之一;2.TNFAIP3基因可能通过去泛素化修饰作用抑制TLR7/TLR9-NF-κB信号通路的激活。而当TNFAIP3基因突变或缺陷时,A20对TRAF6去泛素化作用减弱,使下游NF-κB通路激活和B细胞增殖、分化;3.TNFAIP3基因过表达明显地抑制TLR7/9表达上调,反之TNFAIP3基因沉默可使TLR7/9表达下调。这提示NF-κB调控TLR7/9表达,NF-κB可能通过正反馈机制加重沉默状态下A20诱发的组织炎症损伤。