椎间盘退变性疾病是严重影响患者生存质量的骨科常见病,以颈、背、腰部疼痛和肢体感觉、运动功能障碍为主要症状。虽多数患者经保守治疗可获得缓解,但仍有部分病情严重者需接受手术治疗。手术中,为摘除突出的椎间盘,需切开纤维环或利用原有的纤维环破口进行操作。以往,对纤维环缺损的修复方法包括直接缝合、缺损部位封堵等,动物实验及有限的临床应用表明:这些方法可部分实现纤维环缺损的即时封闭和物理修复,能在一定程度上恢复纤维环的完整性和椎间盘的密闭性,但不能实现良好愈合,也不能促进纤维环和椎间盘的再生,因而所取得的效果有限,纤维环存在破损及愈合不良是引起髓核再突出的重要原因。近年来,组织工程和再生医学技术开始应用于纤维环修复领域,通过构建符合纤维环结构特点的组织工程支架,可向缺损部位载入具有增殖和分化潜力的细胞,使其在缺损部位生长,以实现对缺损部位的修复,为纤维环和髓核的再生创造良好条件。在这一过程中,支架与细胞间需协同作用,以确保细胞的良好生长、增殖和分化,继而提高修复效果。在其他的组织工程研究中,具有多向分化潜力的干细胞被广泛应用于肌腱、软骨、骨等组织的修复中,取得了一定的效果,将其引入纤维环和椎间盘修复的研究也表明,干细胞可对退变或损伤的纤维环和椎间盘起到一定修复作用,但在应用中也需面对局部生长条件差、细胞增殖效率低、分化趋势不明确等困难。为实现更好的修复效果,目前的研究工作之一是对组织工程支架的结构进行改进,通过控制纤维支架的取向、孔隙形状等空间结构属性,模拟纤维环的特定解剖结构,为细胞提供适宜的微环境,以促进干细胞的增殖和分化。在前期的工作中,课题组其他人员应用静电纺丝技术构建了纳米纤维支架。通过改进纺制方法,使支架的纤维具有取向性,以模拟纤维环各向异性的结构特征。支架的纤维呈取向性排列后,其抗拉伸能力明显提高,具备了良好的力学性能,可满足纤维环修复的需要。支架与骨髓间充质干细胞共培养的结果表明,所纺制的纳米纤维支架具有良好的生物相容性,所搭载的细胞可粘附、生长、增殖于支架表面及其内部。另外,将无规纳米纤维支架进行匀浆、冷冻干燥等进一步处理后可获得三维多孔支架,其多孔结构与内层纤维环类似。取向纤维支架与三维多孔支架交联可构成复合支架,以其为载体搭载骨髓间充质干细胞,可实现对动物体内纤维环缺损模型的有效修复。在上述实验中,我们也观察到,支架表面结构不同时,所接种的骨髓间充质干细胞会出现分化差异,具体表现在:接种于取向纳米纤维支架后,干细胞沿支架纤维排列的方向伸展和分布,呈现长梭形的形态,与外层纤维环细胞的形态特点相近,同时,其表型分子mRNA的表达情况也与外层纤维环细胞相符;而在三维多孔支架中的干细胞则长入孔隙内,并呈集落式生长,细胞形态近圆形,近似于内层纤维环细胞的特征,其表型分子mRNA的表达情况也与内层纤维环细胞相符。这些现象表明,纳米纤维支架的表面结构可以对干细胞的分化发挥一定的调控作用,对此种调控作用进行分析和研究,探究其可能的机制、寻找参与调控的因子,有助于更好地构建组织工程纤维环。本研究中,首先构建了具有不同空间结构的纳米纤维支架,分别模拟外层纤维环和内层纤维环的结构,然后接种骨髓间充质干细胞并共培养,通过高通量测序的方法对细胞培养于支架后基因差异表达的情况进行分析;随后检测和比较不同支架中纤维环细胞表型分子mRNA的表达水平,以评估支架结构对骨髓间充质干细胞分化的影响,并探讨Mkx(Mohawk)、Integrinβ1的调控作用;最后,选取结构接近外层纤维环解剖特点的取向纳米纤维支架搭载自体骨髓对兔腰椎外层纤维环缺损进行修复,评估其修复效果。本研究的结果表明:(1)所构建的纳米纤维支架可为骨髓间充质干细胞提供适宜的生长环境,高通量测序结果提示干细胞接种于支架后,与对照组相比有较多差异表达基因,提示支架对干细胞的生物学行为产生了影响,使其在转录层面即出现差异;(2)取向纳米纤维支架可促进骨髓间充质干细胞向外层纤维环细胞分化,Mkx是参与这一过程的调节因子;(3)三维多孔纳米纤维支架可促进骨髓间充质干细胞向内层纤维环细胞分化,Integrinβ1参与这一过程的调节;(4)取向纳米纤维支架-细胞复合体可有效修复兔腰椎外层纤维环缺损。第一部分基于高通量测序的纳米纤维支架表面结构对骨髓间充质干细胞作用分析目的:纺制具有不同表面结构的静电纺丝纳米纤维支架并接种骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells,BMSCs),通过高通量测序评估支架对细胞的作用并分析差异基因表达情况。方法:采用静电纺丝技术,纺制具有不同表面结构的纳米纤维支架,即无规纳米纤维支架(Random Nanofibrous Scaffold,RNS)、取向纳米纤维支架(Aligned Nanofibrous Scaffold,ANS)、三维多孔纳米纤维支架(Three-dimensional Porous Nanofibrous Scaffold,3-DPS)。提取并培养大鼠BMSCs,将其接种于各支架,细胞-支架复合体共培养后以CCK-8法检测细胞增殖情况并比较,以扫描电镜(Scanning Electron Microscope,SEM)对支架表面纤维直径、纤维间夹角等结构特征进行观察,并在细胞培养后对细胞在支架表面的形态进行观察。以HE染色的方法观察细胞在支架表面和内部的生长情况。细胞与支架共培养后行高通量测序,以无支架条件下培养的BMSCs做为对照组,分析各组中细胞差异基因的表达情况,以分析支架对细胞的作用。同时,对ANS、RNS两种支架中BMSCs的差异基因表达情况进行单独比较,以探讨支架的纤维取向对细胞的作用。结果:对各支架的纤维直径和角度进行比较的结果显示:RNS纤维直径(1.22±0.17μm)与ANS(1.12±0.16μm)无显著差异;RNS中纤维间夹角数值的分布情况较为分散,ANS中纤维夹角的数值集中分布在15-35°之间,纤维排列具有取向性;3-DPS的构成纤维在三维空间伸展,纤维直径(1.58±0.29μm)明显大于RNS和ANS,纤维间构成类圆形孔隙。BMSCs接种于各支架后均可良好生长,共培养3d时,3-DPS组的OD值(1.343±0.034)大于其它各组(P<0.0001),ANS组(1.245±0.029)大于RNS(1.193±0.020)组和Control组(1.158±0.024)(P<0.01);培养至7 d时,3-DPS组(1.779±0.034)仍大于其它各组(P<0.01),而RNS组(1.663±0.025)和ANS组(1.685±0.032)则大于Control组(1.542±0.040)(P<0.0001)。SEM结果显示,BMSCs在RNS、ANS中沿纤维伸展,具有外层纤维环细胞的形态特征,而3-DPS中的细胞在孔隙内生长,具有内层纤维环细胞的形态特征。HE染色结果提示BMSCs可良好生长于支架表面并部分进入支架内部。高通量测序的结果表明,与对照组相比,三种支架中的BMSCs在转录层面即出现明显差异;ANS、RNS两种支架中BMSCs的基因表达情况也存在差异。富集分析结果表明:与对照组相比,细胞接种于各支架后在细胞外基质成分及作用、腱性组织发育、胶原纤维连接等方面存在明显基因富集;差异蛋白编码基因的分析提示:PI3K-Akt、粘着斑、细胞外基质受体等多种信号通路相关基因存在富集。Mkx(Mohawk)在ANS组、RNS组中与对照组相比存在表达差异,且在ANS、RNS组的表达情况也有差异。Integrinβ1在3-DPS组中较对照组存在表达差异。结论:所构建的静电纺丝纤维支架具有不同的空间结构,ANS结构类似于外层纤维环,3-DPS结构类似于内层纤维环,各支架均可为接种其上的BMSCs提供良好的生长环境。测序结果表明,纳米纤维支架会对接种其上的BMSCs发挥作用,使其基因表达出现差异,支架对细胞的作用涉及生物学行为的多种方面和不同的生物学过程,并与多种细胞通路相关。Mkx(Mohawk)、Integrinβ1与ANS、3-DPS表面结构对细胞的作用相关。第二部分纳米纤维支架表面结构对骨髓间充质干细胞向纤维环细胞分化的影响及机制研究目的:(1)明确ANS、RNS对BMSCs向外层纤维环细胞分化的促进作用,并比较两种支架对此种分化的影响差异,分析Mkx在这一分化过程中的作用;(2)评价3-DPS对BMSCs向内层纤维环细胞分化的影响并分析Integrinβ1的作用。方法:将BMSCs接种于ANS、RNS、3-DPS三种支架后共培养,行鬼笔环肽及DAPI染色后对细胞形态和细胞骨架的情况进行观察,比较细胞形态差异。其后,(1)以qPCR检测ANS、RNS两组中纤维环细胞表型分子(Col I、Scx、Col II、Sox 9、Bgn、Tnc、Dcn)mRNA的表达情况,将无支架条件下培养的BMSCs做为对照,以明确BMSCs在两种支架中的分化趋势,并进行二者间比较;继而比较以si RNA抑制Mkx的作用后,ANS、RNS中表型分子mRNA表达水平的变化,以探讨Mkx在ANS、RNS结构影响BMSCs向外层纤维环细胞分化过程中的作用。(2)以qPCR检测成软骨诱导培养条件下BMSCs在3-DPS、ANS、RNS中表达内层纤维环细胞表型分子(Col II、Sox 9、Aggrecan)mRNA的水平,并以无支架条件下培养的空白BMSCs做为对照,以明确3-DPS对BMSCs向内层纤维环细胞分化的作用;继而通过构建慢病毒、腺病毒载体分别抑制或上调Integrinβ1的作用,检测3-DPS中BMSCs表达内层纤维环细胞表型分子mRNA水平的变化,以探讨Integrinβ1在3-DPS影响BMSCs向内层纤维环细胞分化过程中的作用。结果:细胞染色后的观察结果提示:接种于ANS、RNS后,BMSCs的外形呈长梭形,细胞骨架分布有极性,符合外层纤维环细胞的形态特征,而3-DPS中的BMSCs形态类似多边形,无极性特征,形态近似内层纤维环细胞。qPCR结果证实,BMSCs在ANS、RNS中表达Col I、Scx mRNA的水平高于对照组(P<0.05),同时Bgn、Tnc、Dcn mRNA的表达水平也高于对照组(P<0.05),且ANS组中的表达水平高于RNS组(P<0.05),以si RNA抑制Mkx后ANS、RNS组中Col I、Scx、Bgn、Tnc、Dcn mRNA的表达水平均下降,而Col II、Sox 9 mRNA的表达水平则升高。在3-DPS中培养的BMSCs表达Col II、Sox 9、Aggrecan mRNA的水平高于对照组、RNS组和ANS组,分别抑制或上调Integrinβ1的作用后,Col II、Sox 9、Aggrecan mRNA的表达水平相应下降或上升。结论:(1)ANS可促进BMSCs向外层纤维环细胞方向分化,Mkx在这一过程中具有促进作用;(2)3-DPS可促进BMSCs向内层纤维环细胞方向分化,Integrinβ1对这一过程具有促进作用。第三部分取向纳米纤维支架修复兔腰椎间盘外层纤维环缺损的体内实验目的:构建兔腰椎外层纤维环缺损模型,以ANS搭载自体骨髓对缺损进行修复,观察修复效果。方法:将18只新西兰大白兔随机分为3组,即对照组、缺损组和修复组,每组均为6只动物。对照组仅切开、分离各层组织并显露L5-6椎间盘;缺损组显露后于L5-6椎间盘外层纤维环制造直径2 mm、深度1 mm的环形缺损;修复组在缺损部位植入混合自体骨髓的ANS进行修复。于术后4、8周行DR检查,计算相对椎间高度指数(relative Disc Height Index,rDHI)并比较,于术后8周处死各组动物并取材,对修复部位进行大体观察、组织病理检查和拉伸力学检测。结果:术后4周,对照组rDHI(1.03±0.09)大于缺损组(0.85±0.12)(P<0.05);术后8周时,缺损组rDHI(0.63±0.06)小于对照组(1.02±0.08)和修复组(0.89±0.11)(P<0.05),修复组的rDHI介于对照组和缺损组之间,与二者均有差异(P<0.05)。以修复部位为中心行拉伸力学检测显示:缺损组最大抗拉强度(6.38±0.99 MPa)最低,与对照组(13.54±1.00 MPa)、修复组(9.60±1.44MPa)均有差异(P<0.05),修复组的最大抗拉强度低于对照组(P<0.05)。病理检查可见修复组缺损部位有修复组织生成,而缺损组修复组织生成不明显。结论:ANS搭载自体骨髓可对兔腰椎外层纤维环缺损进行有效修复。