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目的：本实验室克隆的小鼠腭裂相关基因1(MouseCleftPalateRelatedgenel，简称mcprl)在2002年初被GenBank收录并命名，其前期研究鉴定了mRNA全长，初步建立了mcprl组织表达图谱，并探讨了这个基因在颌面部发育中的时空表达，成功构建了mcprl的绿色荧光真核表达载体，制备了mcprl多克隆抗体。但是，对mcprl的功能仍有许多未知之处，在本实验研究工作中，我们从该基因编码蛋白MCPRl在小鼠胚胎发育不同时期的表达变化；亚细胞定位；过表达与抑制表达对小鼠腭突间充质细胞(MEPM)生物学特性的影响；mcprl与维甲酸(RA)的关系等方面对其功能做了初步的分析。为进一步深入地研究该基因的功能和相应蛋白的功能奠定基础。
方法：①mcprl在小鼠胚胎发育中的表达研究取妊娠12、14、18天的C57BL/6N近交系孕鼠引颈处死，取出胎鼠，置于40g/L多聚甲醛中4℃固定24h,胎鼠侧面部朝下石蜡包埋，制备5μm厚连续切片。免疫组化检测，观察mcprl的蛋白表达情况。②mcprl的亚细胞定位研究取妊娠第12.5天的C57BL/6N孕鼠引颈处死，在75％酒精中浸泡10s，无菌条件下取出胚胎，放在PBS中，在显微镜下分离腭突。用组织块法进行原代培养，倒置显微镜观察细胞生长情况，待细胞生长密度接近80％，0.25％胰酶消化，传代。取第3代的细胞爬片，按免疫组化检测试剂盒所示程序进行免疫组化染色。以角蛋白、S-100蛋白和波形蛋白多克隆抗体为一抗，鉴定细胞来源。培养5代后用于实验。提取MEPM细胞胞浆蛋白和胞核蛋白，采用本实验室制备的mcprl多克隆抗体，应用WesternBlot技术检测mcprl在胞浆及胞核中的表达以进行MCPR1蛋白的亚细胞定位。③mcprl对腭突间充质细胞生物学特性的影响利用前期实验构建的pEGFP-N3-mcprl及反义pEGFP-N3-mcprl真核表达载体，采用脂质体介导方法，按照invitrogen公司产品说明书的方法用Lipofectamine2000TM将pEGFP-N3-mcprl及反义pEGFP-N3-mcprl真核表达载体瞬时转染到MEPM细胞中，同时设空载体转染组和空白对照组，MTT法检测转染后细胞增殖情况，流式细胞仪分析转染pEGFP-N3-mcprl及反义pEGFP-N3-mcprl真核表达载体对MEPM细胞周期的影响。④mcprl与RA的关系将成功转染了pEGFP-mpcrl正义载体和反义pEGFP-mpcrl载体的MEPM细胞72h后传代入六孔板后，随机分为RA诱导正义转染组(A组)、RA诱导反义转染组(B组)、RA诱导未转染组(C组)、正常对照组(D组)。各诱导组加入1×10-8mol/L浓度的ATRA(用无水乙醇稀释)，对照组加入同等剂量的无水乙醇。MTT检测各组细胞增殖情况；同时用Western-Blot法检测MCPRl表达情况的改变；流式细胞仪检测细胞周期变化。
结果：①免疫组化结果显示MCPRl在小鼠胚胎多组织的发育中呈现不同的表达模式，在E14时，Meckel软骨内有少数MCPRl阳性表达细胞，软骨周围阳性细胞较多；在E18，Meckel软骨内MCPRl阳性表达细胞增多，且前部较后部多。②对提取的MEPM细胞胞浆蛋白和胞核蛋白进行WesternBlot结果显示在胞浆蛋白中MCPRl阳性条带明显，而胞核蛋白中无明显阳性条带。③MTT检测结果显示反义转染组MEPM细胞增殖活性明显高于正义转染组和空白对照组；流式细胞仪检测结果显示反义转染组MEPM细胞处于S期、G2及M期的细胞比例明显高于正义组及空白对照组，具有显著差异。表明反义表达载体转染后处于DNA合成期及合成后期的细胞显著增多。④MTT检测结果显示B组细胞增殖活性与D组差异无统计学意义。流式细胞仪检测结果显示B组处于S期、G2及M期的细胞比例与D组无显著性差异。WesternBlot结果表明mcprl在RA诱导的A组及C组中表达较强，在B组中最弱。
结论：①推测mcprl在颅神经嵴细胞成骨过程中可能以促PCD基因的身份在软骨细胞的移行中发挥作用；在胚眼发育中的时空表达变化提示mcprl可能在视泡的形成及晶状体等眼部结构的发生发展中起着一定的作用。②WesternBlot结果说明mcprl的蛋白表达产物定位于细胞浆，mcprl蛋白属胞浆蛋白，与生物信息学预测及前期实验原位杂交结果及细胞免疫组化染色结果相一致。亚细胞定位的进一步明确，为后续研究致畸剂如维甲酸作用下MEPM细胞内mcprl的表达变化，以及封闭mcprl后MEPM细胞生物学行为的改变提供实验依据。为进一步研究该蛋白的功能打下了坚实的基础。③通过pEGFP-N3-mcprl及反义pEGFP-N3-mcprl真核表达载体的转染证明了mcprl的反义真核表达载体可以在蛋白水平有效的封闭mcprl的表达，表明反义真核表达载体封闭效果的可靠性，更为有意义的是显示了mcprl的表达降低后，细胞的增殖指数明显增高，提示mcprl可能通过参与细胞凋亡等负反馈机制调控细胞的生长，从而在胚胎发育过程中发挥着相应的作用。④转染了反义pEGFP-N3-mcprl真核表达载体的MEPM细胞在RA诱导的条件其生物学特性未显著变化，说明该反义表达载体对RA有拮抗作用，进而提示mcprl可能作为RA的下游作用分子，通过参与细胞凋亡的调控而在胚胎颌面部发育中发挥重要作用。