论文部分内容阅读
研究背景帕金森病(Parkinson’ s Disease,PD)是一种多发于中老年人的进行性中枢神经系统退行性疾病。其病理特征主要为中脑黑质致密区多巴胺神经元变性缺失为主,导致纹状体内多巴胺水平降低。从而引起一系列运动障碍,如:静止性震颤、肌肉僵直、运动缓慢等。对于PD目前尚无根治方法,西医对PD的治疗多以左旋多巴治疗为主,主要改善患者临床症状,但长时间使用会出现异动症等毒副作用。而传统中医药由于其独特的理论及系统整体的防治方法,在防治PD上具有毒副作用小、疗效稳定的优点。目前普遍认为PD是基因、环境和老龄化因素共同作用的结果,其具体发病机制仍不太明确。现已证实线粒体功能障碍与PD发病密切相关。PINK1是一种与PD发病的相关基因,突变后可引起线粒体形态及功能异常,PINK1表达正常可以保护线粒体抵抗内源性和外源性因素损伤,在维持线粒体正常功能及保护多巴胺神经元中发挥着重要作用。大补阴丸(Da-Bu-Yin-Wan,DBYW)和牵正散(Qian-Zheng-San,QZS)均是临床治疗PD的常用方,课题组前期研究证实了 DBYW和QZS在一定程度上可调控PD小鼠脑线粒体基因的表达、减轻线粒体DNA的损伤,对PD动物脑线粒体和PD细胞模型线粒体功能具有明确的保护作用,两方合用效果更明显。在此研究的基础上,本实验以PINK1基因为切入点,将中医药理论和现代分子生物学技术相结合,进一步从细胞、分子水平研究中药复方的作用环节和机制。研究目的本研究以PINK1基因为切入点,通过质粒转染SH-SY5Y细胞构建PINK1敲减模型,MPP+诱导SH-SY5Y细胞构建PD模型,阐明DBYW合QZS对PD细胞中线粒体形态和功能的保护作用与PINK1基因调控的相关性,并进一步揭示该中药复方与线粒体重塑密切相关的PINK1蛋白、Parkin蛋白及线粒体分裂融合蛋白之间的联系。为临床应用DBYW合QZS治疗PD提供科学依据,也为中医复方理论提供科学内涵和实验依据,为其进一步利用提供可靠实验平台。研究方法实验一PINK1基因敲减细胞模型的构建:实验分3组:①正常对照组;②空载对照组;③PINK1敲减组。荧光显微镜观察SH-SY5Y细胞转染情况;流式细胞检测技术检测SH-SY5Y细胞转染效率;RT-PCR技术检测PINK1 mRNA的表达;Western Blot技术检测PINK1蛋白的表达。实验二大补阴丸合牵正散对PINK1基因敲减PD细胞模型线粒体形态和功能的影响:实验分6组:①空载质粒对照组;②空载质粒模型组;③空载质粒治疗组;④PINK1敲减对照组;⑤PINK1敲减模型组;⑥PINK1敲减治疗组。CCK-8法检测各组细胞的存活率;MitoTracker(?)Red CMXRos探针标记线粒体并在激光共聚焦显微镜观察线粒体的形态及荧光强度;荧光素酶法检测细胞中ATP的水平;线粒体探针TMRM检测线粒体的膜电位。实验三大补阴丸合牵正散对PINK1基因敲减PD细胞模型线粒体质量相关蛋白的影响:分组同实验二。Western Blot技术检测:①与线粒体质量相关蛋白PINK1和Parkin的表达;②与线粒体融合相关的融合蛋白1(Mfn1)和融合蛋白2(Mfn2)的表达;③与线粒体融合相关蛋白视神经萎缩蛋白OPA1的表达;④与线粒体分裂相关的动力相关蛋白1(Drp1)和线粒体分裂蛋白1(Fis1)的表达。研究结果实验一结果:1.绿色荧光蛋白的表达及细胞转染效率的测定:空载对照组及基因敲减组可观察到较多的绿色荧光蛋白表达,且转染48h后的转染效率更高。2.PINK1 mRNA及蛋白的表达:PINK1敲减组SH-SY5Y细胞内的PINK1 mRNA和蛋白的表达均显著降低(P<0.05),说明可成功构建PINK1基因敲减细胞模型。实验二结果:1.细胞存活率的变化:MPP+可造成模型组细胞存活率均明显下降(P<0.05);DBYW合QZS可使空载质粒治疗组细胞存活率显著增高(P<0.05);而PINK1敲减治疗组细胞存活率无显著差异。2.线粒体形态和荧光强度的变化:MPP+可使模型组线粒体网格减少,碎片增多,形态因子均显著下降(P<0.05),线粒体荧光强度显著下降(P<0.05);DBYW合QZS处理后,空载质粒治疗组线粒体形态因子及荧光强度均显著升高(P<0.05);而PINK1敲减治疗组细胞线粒体形态因子及荧光强度均无明显改变。3.线粒体功能的变化:MPP+可使模型组线粒体△Ψm 和ATP水平均显著下降(P<0.05);与空载质粒对照组相比,PINK1敲减后可使线粒体△Ψm和ATP水平均显著下降(P<0.05);DBYW合QZS处理后,空载质粒治疗组线粒体△Ψm和ATP水平均显著升高(P<0.05);而PINK1敲减治疗组细胞线粒体△Ψm和ATP水平均无显著差异。实验三结果:1.PINK1和Parkin蛋白的表达:MPPF可使模型组细胞PINK1和Parkin蛋白的表达水平均显著下降(P<0.05);与空载质粒对照组相比,PINK1敲减后可使细胞PINK1和Parkin蛋白的表达水平均显著下降(P<0.05);DBYW合QZS处理后,空载质粒治疗组细胞PINK1和Parkin蛋白的表达水平均显著升高(P<0.05);而PINK1敲减治疗组细胞PINK1和Parkin蛋白的表达水平均无明显改变。2.线粒体融合相关蛋白Mfn1、Mfn2、OPA1(OPA11和OPA12)及线粒体分裂相关蛋白Drp1和Fis1的表达:MPP+可使模型组细胞线粒体融合及分裂蛋白的表达水平均显著下降(P<0.05);与空载质粒对照组相比,PINK1敲减后可使细胞线粒体相关融合蛋白Mfn2及OPA12的表达水平显著升高(P<0.05);DBYW合QZS处理后,空载质粒治疗组细胞线粒体融合及分裂蛋白、PINK1敲减治疗组细胞线粒体融合蛋白的表达水平均显著升高(P<0.05),而PINK1敲减治疗组细胞线粒体分裂相关蛋白的表达水平无显著改变。结论DBYW合QZS对MPP+造成的SH-SY5Y细胞线粒体的损伤有一定保护作用,其机制与PINK1基因有关。PINK1可能通过调节Parkin及线粒体分裂融合相关蛋白的表达保持线粒体的动态平衡,来维持线粒体的形态和功能。