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洋葱(Allium cepa L.)具有丰富的营养价值和药用价值,是我国的主栽蔬菜之一,在我国种植广泛。洋葱属于百合科葱属,是典型的二年生植物,其抽薹开花受到外界环境和内部因素的影响。适宜的开花时间不仅能提高产量,还能提高植物对环境的适应性。因此,人为调控开花对指导农业生产具有重要意义。模式植物中的研究表明,主要有6大途径参与植物的开花调控,其中,赤霉素(GA)途径对植物开花尤为重要。DELLA蛋白是GA途径的负调控因子,也是多种途径的整合信号因子。DELLA蛋白属于GRAS大家族,GRAS是一种重要的转录因子,对植物的生长具有重要的调节作用。为了进一步探究GRAS家族对于开花的影响,本文从洋葱转录组数据库挑选了9个典型的GRAS家族基因,分别以洋葱抽薹前2天和抽薹后1天的叶片提取RNA后反转的cDNA为模板,经q PCR筛选,选择抽薹前后表达差异极显著的2个基因AcGAI和AcSCL4为候选基因,构建了这2个基因的植物过表达载体,在拟南芥上分析了AcGAI和AcSCL4对开花的影响,并通过酵母双杂试验进一步验证AcGAI、AcCO的互作关系。现将试验结果总结如下:(1)依据洋葱转录组数据库,对AcGAI、AcSCL4的CDS区进行克隆。AcGAI大小为1575 bp,推测编码524个氨基酸;AcSCL4大小为1515 bp,推测编码504个氨基酸。(2)DNAMAN比对后发现,AcGAI具有典型的DELLA结构域和GRAS结构域,与拟南芥、铁皮石斛、油棕的同源性大于50%;AcSCL4在N端高度变异,只在C端较为保守,有GRAS结构域,同拟南芥、铁皮石斛、石刁柏等7个物种的SCL4的蛋白同源性为56.36%。聚类分析表明,AcGAI和油棕的GAI蛋白亲缘关系最近,AcSCL4和石刁柏的SCL4蛋白亲缘关系最近。(3)构建了AcGAI、AcSCL4的过表达载体p B221-3300-AcGAI(AcGAI-OE)和p B221-3300-AcSCL4(AcSCL4-OE),并将融合质粒转化到农杆菌GV3101感受态细胞中,用花序浸染法转化拟南芥,获得转AcSCL4-OE阳性植物4株,AcGAI-OE阳性植物4株,AcGAI转della突变体(AcGAI-della)阳性植物6株,AcGAI转gai突变体(AcGAI-gai)4株。过表达转基因植株后代均表现为开花抑制,且抑制程度AcGAI强于AcSCL4。和野生型相比,AcGAIOE过表达植株除表现出极显著的晚花表型外,植株亦发生严重矮化,且莲座叶数目显著增加,侧枝减少,果荚短而粗壮,并且荚数显著减少;AcSCL4-OE过表达植株和野生型相比,抽薹开花时间晚于野生型,也出现矮化现象。将AcGAI转入gai、della突变体中,不同程度地改变了gai和della突变体的早花性状,和野生型相比,在突变体的基础上进一步表现出晚花、矮化、莲座叶数增加。说明AcGAI是一个强烈抑制开花的基因,并且系统性地抑制植物的生长发育。(4)为了进一步探究AcGAI和AcSCL4调控开花的机理,以q PCR检测转基因株系及各突变体植株中的CO、FT表达情况。无论是与野生型还是gai突变体、della突变体相比,相对应的AcGAI-OE转基因植株CO和FT的表达量均显著下降,充分说明了AcGAI可以通过抑制CO、FT的表达来抑制开花;在AcSCL4-OE的过表达株系中,CO、FT的表达量亦显著下降,说明AcSCL4抑制开花也通过CO/FT途径。(5)为了研究AcGAI和AcCO是否存在互作,本试验以p GBT9为阳性对照,AD和BD共转化的空载体为阴性对照,AcCO-AD作为猎物蛋白,AcGAI-BD作为诱饵蛋白进行互作研究,同时用AcCO-AD/BD和AcGAI-BD/AD进行自激活检测,结果发现在四缺培养基上,AcGAI-BD/AcCO-AD的共转化质粒均出现了和阳性对照相同的现象,菌斑变蓝,而阴性对照和基因+质粒AD或BD空载体均不能正常生长。体外试验表明,AcGAI和AcCO存在互作。(6)为了研究AcGAI-OE和AcSCL4-OE过表达种子对脱落酸(ABA)、多效唑(PAC)及GA的敏感程度,分别用等浓度的ABA和PAC处理其过表达种子。发现经过ABA处理,所有种子的萌发率均下降,两种过表达种子均对ABA反应敏感,且AcSCL4-OE程度强于AcGAI-OE;经过PAC处理,所有种子的萌发率亦下降,AcGAI-OE对PAC反应极敏感,而AcSCL4-OE反应不敏感。用不同浓度的GA处理后发现,在一定浓度范围内AcGAI-OE种子对GA处理反应敏感,相同浓度下下胚轴伸长程度较大,但AcSCL4-OE较野生型变化不明显,推测这种差异是由于DELLA结构域在响应GA信号方面发挥关键作用所致。