论文部分内容阅读
世界卫生组织（WHO）统计,2016年有1790万人死于心脑血管疾病,占全球死亡人数的31%,其中85%的患者死于脑卒中和心脏病,且超过四分之三发生在中、低收入国家。研究表明,中国的脑卒中发生率正以每年近9%的速率上升。2019年,由中国疾病预防控制中心与美国华盛顿大学健康测量及评价研究所（IHME）合作完成一项分析报告也显示:脑卒中已经成为导致中国人早逝的前三大主因之一。除此之外,脑卒中的复发率较高,高达54%的复发病人出现了残疾失能症状。S-腺苷同型半胱氨酸（Sadenosylhomocysteine,SAH）是甲硫氨酸循环的中间产物,近年来其作为比同型半胱氨酸（Homocysteine,Hcy）更敏感的心脑血管病危险因子引起了人们的广泛关注。有研究发现SAH水平增加可增加脑静脉血栓的患病风险,但其确切的作用机制及在缺血性卒中发生中的影响尚不明确。本研究就缺血性卒中发生的主要始动环节—脑血管内皮细胞损伤,利用小鼠脑微血管内皮细胞株b End3,从分子水平上建立3-脱氮腺苷（3-Deazaadenosine,3-DZA）阻断甲硫氨酸循环中SAH向Hcy转化过程对b End.3细胞损伤模型并研究其作用的分子机制。本研究对进一步认识SAH在缺血性卒中中的作用、推动脑卒中预防和诊治、提高脑卒中患者及高危人群生活质量、减轻脑卒中造成的社会负担具有重要意义。第一部分SAH诱导脑微血管内皮细胞凋亡细胞模型的建立目的:通过3-DZA阻断SAH转变为同型半胱氨酸,建立S-腺苷同型半胱氨酸升高诱导脑微血管内皮细胞凋亡的细胞模型。方法:利用3-DZA阻断SAH转变为同型半胱氨酸,采用CCK-8法检测b End.3细胞的活力变化,确定最佳诱导损伤的时间和浓度,进一步采用流式细胞术测定最佳干预时间和浓度下细胞凋亡的情况,建立细胞凋亡的模型。结果:分别用浓度为0、100、200、400、600、800、1000、1500、2000μmol/L的3-DZA干预b End3细胞0h、24h和48h。随着处理时间的增加,细胞活力逐渐降低（P<0.05）。当使用3-DZA浓度为200、400μmol/L处理48h时,细胞损伤所致细胞存活率适中。因此进一步选取100、200、400、600μmol/L的3-DZA对b End3细胞进行干预做稳定性实验,结果显示,3-DZA浓度≥200μmol/L均可使b End.3细胞的存活率降低（P<0.05）;3-DZA≥400μmol/L时,b End3细胞的存活率显著降低（P<0.01）。细胞损伤稳定性较好,适于建立损伤模型并用于后续研究。流式细胞仪检测结果显示,正常的b End3细胞凋亡率为（0.63±0.061）%,不同浓度3-DZA处理后,凋亡率增加到（1.03±0.067）%3.12±0.040%,并随3-DZA浓度增加而增加,任意两组比较,差异均有统计学意义（P<0.01）。结论:3-DZA诱导SAH升高诱导b End3细胞凋亡的模型具有稳定、快速、简单的特点,可进一步用于后续实验的研究。第二部分SAH对脑微血管内皮细胞损伤作用及分子机制研究目的:通过细胞生物学的方法,评价3-DZA诱发SAH升高对b End3细胞凋亡产生的影响,探明其对b End3细胞凋亡损伤的分子机制。方法:分别用不同浓度3-DZA干预b End3细胞48h后,采用活性氧检测试剂盒检测细胞活性氧（Reactive oxygen species,ROS）水平;采用蛋白免疫印迹（Western Blot）技术,检测bcl-2、bax、caspase-9、caspase-3蛋白的表达水平,明确3-DZA诱导SAH升高促b End3细胞凋亡的分子作用机制。结果:与正常对照组比较,不同浓度3-DZA干预组b End3细胞ROS水平升高,以300μmol/L、400μmol/L最显著（P<0.01）;Western-blot实验结果显示与正常对照组相比,400μmol/L 3-DZA干预b End3细胞bcl-2基因表达水平显著降低（P<0.05）,其他干预组与对照组差异无统计学意义,各干预组bax、caspase-9、Cleaved caspase-3基因表达水平显著上调（P<0.01）。结论:3-DZA诱导b End3细胞凋亡作用的机制是通过上调细胞ROS水平,调节线粒体相关凋亡信号通路,下调bcl-2蛋白表达,上调bax、Cleaved caspase-3、caspase-9蛋白的表达促进细胞凋亡线粒体途径,促进b End3细胞凋亡的作用。3-DZA可以通过上调细胞ROS水平,调节线粒体相关凋亡信号通路,下调bcl-2蛋白表达,上调bax、Cleaved caspase-3、caspase-9蛋白的表达促进线粒体凋亡,进而促进b End3细胞的凋亡。