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阿片肽是一类具有阿片作用的生物活性肽,其生物活性主要表现在如下方面:促进摄食、镇痛、镇静、抑制胃肠道运动和消化液的分泌、调节内分泌和免疫、促进电解质的吸收、和调节心血管系统功能等。其高效、无毒副作用等优点可以广泛地应用于医药、食品、饲料工业等行业中。而利用基因工程菌表达阿片肽是一种获得阿片肽的有效途径。本论文主要是研究一株表达阿片肽的毕赤酵母基因工程菌。本文采用两步发酵法——工程菌生长阶段和表达阶段,来研究毕赤酵母基因工程菌。通过正交实验确定了工程菌的最佳生长条件为:甘油24g/L,酵母膏11g/L,蛋白胨22g/L,YNB 30ml/L,初始pH5.0,摇床转速250r/min,培养温度30℃,优化后的菌体密度达到了2.461,菌体干重18.24g/L。在工程菌细胞破碎的研究中确定了最佳破碎条件和方法,即玻璃珠法与与超声波法的结合破碎法和最佳破碎pH为6.0。破碎后的上清液用10%三氯乙酸溶液沉淀除去大分子蛋白后进行Sephadex G-10层析,分离得到6个峰,并对这6个峰的产物进行离体豚鼠回肠活性鉴定,发现峰1、3和4具有阿片活性,为目的蛋白。现在常用的定量阿片肽的方法都无法对未知阿片肽进行定量,由于大多数阿片肽在其N-末端都有Tyr残基,因此本实验引进一种用于定量N-末端含Tyr肽的荧光衍生化法来定量检测阿片肽。本工程菌的目的蛋白为1、3和4号峰中的活性阿片肽,因此可通过比较这3个峰面积之和的大小来确定目的蛋白表达量的变化。优化后表达阶段的发酵条件为:初始表达pH6.25,甲醇诱导浓度0.6%,流加甲醇1次/10h,菌体起始浓度OD6002.436,诱导表达时间96h,诱导温度24℃,诱导48h开始每24h添加1g/L的甘油,转速250r/min。毕赤酵母工程菌在上述优化后的条件下生长表达,其胞内表达N-末端含Tyr肽的含量从优化前的196mg/L提高到537mg/L。