研究背景肾母细胞瘤(nephroblastoma)又被称为称肾胚胎细胞瘤(wilms瘤,WT),是全世界儿童最常为见的腹膜后实体肿瘤之一。在小儿腹部恶性实体肿瘤中发病率高,15岁以下青少年的泌尿生殖系肿瘤中有80%以上为WT。目前手术仍是其主要的治疗方法,有数据显示该肿瘤的手术切除率几乎达到100%,其5年生存率也达到近80%左右。研究人员普遍认为该疾病的早期诊断、早期手术切除对于提高患儿长期生存率具有重要意义,同时发现术后复发是影响生存率的重要因素。但是,无论是初发或是术后复发患儿,为了达到临床治愈的目的,及早发现、及时治疗还是非常有必要的。因此我们认为,在该肿瘤的治疗过程中,其术后随访十分重要,通过随访,我们可以较早的发现肿瘤复发、转移的情况,从而采取及时的治疗措施、并最终提高患者的生存率。目前,临床上关于该肿瘤的术后监测主要根据临床症状外加辅助检查,如超声、静脉肾盂造影、CT等来确诊,但这些检查手段的敏感性较差,只有当肿瘤长到一定大小时才能被发现,因此在一定程度上延误了治疗时机。更令人沮丧的是,目前尚未有研究发现用于诊断肾母细胞瘤、同时具有较强特异性的生物学标记物。因此,寻找一种简单、快速、敏感性高和特异性强的用于肾母细胞瘤诊断和预后监测的新方法具有重要的临床意义。任何肿瘤的发生都是一个复杂的过程,基因、环境、个体差异等众多因素都在其中起到了重要作用。正常机体中癌基因和抑癌基因之间存在着平衡,该平衡一旦被打破,往往会导致肿瘤的发生。癌基因激活或者抑癌基因失活是肿瘤发生的原因之一,其过程往往涉及多个基因,当这些基因突变或调控异常时,通过转录和翻译而产生的胞内蛋白质的成分及数量上都会有产生相应的变化,因此有学者推论,我们可以通过动态观察蛋白质进一步了解肿瘤的发生及发展状况,以及有无复发或转移等动态变化。蛋白质组学也成为了首选的实验方法,其目的在于阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式,内容包括鉴定蛋白质的表达、存在方式(修饰形式)、结构、功能和相互作用等,该学科的发展为肿瘤预后监测提供了新的思维和技术平台。近年来,蛋白质组学的发展突飞猛进,在肿瘤标记物检测方面取得了重要的进展,也为肿瘤早期的正确诊断提供了新方法,目前,蛋白质组学技术已经被广泛应用于为多种恶性肿瘤寻找合适生物标记的研究中。在肾母细胞瘤中,研究者多使用表面增强激光解析电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术进行差异蛋白的筛选,从而发现肾母细胞瘤患儿血清与正常血清中的差异性蛋白以及肾母细胞瘤患儿血清与肾母细胞瘤细胞株总蛋白中的差异蛋白。同时,结合MALDI-TOF-MS、LC-MS/MS等可实现对肿瘤血清中特异性标记物的鉴定。但迄今为止尚未有该肿瘤相关的特异性蛋白质成功应用于临床的报道。我们认为在肿瘤的发生过程中存在的合并症及并发症、以及肿瘤环境特有的炎症和免疫缺陷的情况都参与了肿瘤的发生发展过程,在肿瘤环境下产生的细胞因子及炎症因子等均和肿瘤都存在着一定的相关性,只有排除这些物质的干扰,才能筛选出具有肿瘤特异性的蛋白质标记物。本研究采用在裸鼠体内建立肾母细胞瘤模型的方法,在最大程度上排除了机体本身存在的炎症或其他合并症对肿瘤发生发展产生的影响,同时由于实验组小鼠均接种相同剂量的肿瘤细胞,因此所产生的疾病进展状况相差不大,组内实验对象呈正态分布。在对人体进行数据分析时,往往因为年龄性别或疾病进展状况不同不能得出具有统计学意义的数据,肾母细胞瘤裸鼠模型则克服了这些不足之处。本研究的目的即寻找一种或几种可用于肾母细胞瘤临床标记物的蛋白,其具体方法为：首先应用SELDI-TOF-MS芯片技术对肾母细胞瘤模型小鼠及对照组小鼠血清进行检测,并结合生物信息学对其进行分析处理,筛选出肾母细胞瘤血清特异性蛋白质峰,随后联合HPLC、MALDI-TOF-MS及LC-MS/MS等蛋白质组学技术对这些差异性蛋白质波峰进行分离、纯化、鉴定,最后则应用Western Blotting方法对所鉴定出来的蛋白质进行验证。研究目的筛选、鉴定并验证可用于肾母细胞瘤血清学诊断的特异性蛋白质标记物。材料与方法1细胞培养接种于裸鼠体内的人肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞购自上海拜力生物科技有限公司,在含有10%胎牛血清(FCS)的1640培养基中进行培养。2人肾母细胞瘤裸鼠模型的建立对8周龄雄性裸鼠单侧腹壁皮下注射人肾母细胞瘤细胞用以建立肾母细胞瘤裸鼠模型,皮下注射1X106个细胞。25天后观察到肿瘤增大至2-3cm时处死小鼠,取肿瘤组织进行H-E染色确认造模成功。3主要试剂和仪器SELDI-TOF-MS相关试剂购于美国Sigma公司,蛋白质芯片生物系统(Ciphergen PBSⅡ+SELDI-TOF-MS)和WCX2芯片购于美国Ciphergen公司。Ziptip C18购于美国Millipore公司,胰蛋白酶购于美国Promega公司,碘乙酰胺(IAM)购于德国Applichem公司,二硫苏糖醇(DTT)购于德国Bio-rad公司。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)购于英国Kratos Analytical公司,高效液相色谱(HPLC)购于日本Shimadzu公司,液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)购于美国Thermo Electron公司。4实验方法4.1 SELDI-TOF-MS蛋白质芯片操作程序4.1.1小鼠处死后收集全血,经8000r／min离心2次后得到血清标本。4.1.2取96孔板置冰盒上,每孔加10μl血清和20μlU9缓冲液,放入4℃层析柜振荡30 min(600 r／mmin)。4.1.3提前15 mmin做芯片预处理,即在加样器中装入芯片,每孔加醋酸钠200μl,层析,记下芯片号并重复操作1次。4.1.4在冰上放置用U9处理后的96孔板,每孔加醋酸钠185μl后层析。4.1.5将已处理的样本取100μl加到芯片上并在4℃层析柜内结合60min(600r／min),取出芯片尽快出去多余液体并晾干。4.1.6随后加醋酸钠200μ1,振荡,甩掉,拍干,以上操作重复3次。4.1.7最后加入200μl去离子水进行冲洗,以除去残液,本次操作重复2次。4.1.8风L干芯片,每孔分别加入50%饱和的SPA 1μ1,共操作两次,干燥后上机待测。4.2收集数据、处理及统计学分析4.2.1首先将原始数据用Proteinchip Software 3.1进行校正,以达到总离子强度与分子量的均一化,然后收集数据；4.2.2采用Biomarker Wizard和ZUCI-ProteinChip Data Analyze System软件包进行分析,同时去掉过滤噪音,并减掉基线。随后找出样本各自的峰,同时过滤掉信噪比小于2的峰。设定10%为聚类分析的最小阈值,最后将各个样本中m／z的差异小于0.3%的峰聚为一类。4.2.3采用Wilcoxon秩和检验对初步筛选出的m／z峰进行统计,P值<0.01说明每个峰区分不同组别的能力有差异。4.2.4采用支持向量机技术对数据进行进一步的分析,寻找可用于肾母细胞瘤早期诊断及预后监测的蛋白标记物。4.3差异性蛋白质峰的纯化4.3.1取血清100 ul,加入350ul超纯水；再加入700ul纯CAN。4.3.2将上述液体混合,并置入-20℃冰箱中放置半小时,取出后用离心机13000转离心10分钟。4.3.3将离心后的上清液吸出后移入新的试管,在SPD SpeedVac中冻干约20分钟。4.3.4采用高效液相色谱(HPLC)对冻干后的样品进行蛋白纯化。收集不同时间的纯化液。4.3.5将纯化的蛋白液取出,放入SPD SpeedVac中继续冻干直至20ul。4.3.6将不同时间点收集的蛋白液取1.5ul,分别与1.5ul CHCA混合,将混合物放入靶板上待干,同时进行校样。4.3.7将靶板置于MALDI-TOF-MS仪器中检测,以跟踪目的蛋白质。4.4蛋白质标记物的鉴定4.4.1将含有目的蛋白质的蛋白液用超纯水定容为40 ul,同时加入浓度0.1mol的DTT溶液4 ul,将该混合物置于37℃温水中水浴1小时。4.4.2向该混合物中再加入1.6ul的IAM(碘乙酰胺),放置1小时(避光)。4.4.3分别向新的混合物中加入1.6ul,lmol的DTT溶液,150ul,0.1mol NH4HC03(碳酸氢氨)溶液和2ul的胰蛋白酶,并置于37℃水中过夜或者水浴6-8小时。4.4.4将酶解后的蛋白液填柱上样到毛细色谱柱。4.4.5将毛细色谱柱放入nano-LC-ESI-MS/MS中进行分析,液质联用质谱扫描由于得到得肽质量指纹图谱,经过检索与数据查询,得到其相对应的可能蛋白质。4.5蛋白质标记物的验证本研究采用western blotting的方法对上述鉴定出的目标蛋白质进行验证,取纯化后的蛋白进行电泳,之后将蛋白质转移到PVDF膜上,将特异性的抗体加入后进行孵育并显色,观察蛋白条带所处的位置,用来判断其是否为目的蛋白。结果1差异性蛋白质峰的检测实验组和对照组小鼠原始质谱数据经过一系列标准化处理之后,再经过聚类分析得到各自样本的峰,用Wilcoxon秩和检验对峰的相对强度进行统计学分析,将p<0.01定为基准进行筛选,得到有意义的m／z峰共18个,其中有8个m／z峰在实验组小鼠中高表达,其余的呈低表达状况。采用SVM方法对具有显著差异性蛋白质峰的组合进行筛选,发现m／z峰值位于6207.9和4509.2的蛋白标记物2个。与对照组相比,肾母细胞瘤小鼠中m／z峰值位于6207.9的蛋白质明显高表达,而峰值位于4509.2的蛋白质表达明显降低。2差异性蛋白质峰的判断为了确定上一部分结果所得到的蛋白质峰的准确性及可靠性,对所有血清学标本采用盲法测试进行验证,结果显示本研究所用的模型区分肾母细胞瘤小鼠和对照组小鼠的敏感性为93.38%,特异性为91.46%,阳性预测值为94.27%。3蛋白质标记物的纯化与鉴定HPLC技术用于对m／z峰位于6207.9和4509.2的蛋白标记物进行分离纯化。纯化结束后酶解目标蛋白质,并用nano-LC-MS/MS方法对酶解后产生的多肽混合物进行检测分析。检测显示：m／z峰值位于4509.2的蛋白质被鉴定为载脂蛋白AⅡ,m／z峰值位于6207.9的蛋白质被鉴定为聚泛素蛋白。4蛋白质标记物的验证本研究采用western blotting的方法进行验证,观察到m／z峰值位于4509.2的蛋白质可以和载脂蛋白AⅡ的特异性抗体结合,而m／z峰值位于6207.9的蛋白质则可被聚泛素的特异性抗体所结合。结论m／z峰位于4509.2和6207.9的蛋白质分别被鉴定为载脂蛋白AⅡ和聚泛素蛋白。对这两种蛋白质进行检测,可以有效的区分实验组(肾母细胞瘤)小鼠和对照组(非肾母细胞瘤)小鼠,在肾母细胞瘤的诊断中具有一定的意义和潜在的应用前景。本实验是在有限样本内进行的动物实验研究,下一步还需要将其应用于临床研究,使之具有更高的准确率和实用性。此外,我们的研究还发现, SELDI-TOF-MS芯片分析、MALDI-TOF-MS跟踪监测、HPLC纯化及LC-MS/MS鉴定等一系列蛋白质组学技术的联合应用具有极高的实用价值和研究价值,将为肿瘤蛋白质标记物的筛选、检测和鉴定提供更加广阔的技术平台和应用空间。