中国梨的栽培面积和产量均居世界首位,但由葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)所引起的梨轮纹病在梨主产区的发生较为普遍,对梨产量、品质构成较大威胁,生产上对解决此问题的需求日益迫切。具有弱毒特性的真菌病毒具有潜在的生防价值,本研究以从我国梨轮纹病样中分离的B.dothidea为材料,开展B.dothidea携带病毒多样性研究,并对新鉴定出的真菌病毒分子生物学特性进行系统性研究,为深入了解来源于B.dothidea中的真菌病毒特性提供新的有用信息和完善真菌病毒分类系统提供试验支撑,并为梨病害绿色防治提供新的具有生防潜能的真菌病毒资源。主要研究结果如下:1.葡萄座腔菌病毒的多样性通过对来源于我国8个省的梨产区289个B.dothidea菌株的双链RNA(ds RNA)进行检测后,发现这些菌株在0.8-10.0 kb之间共携带有22种不同大小的ds RNA片段,说明这些菌株中携带有丰富的ds RNA病毒。其中在5.0-7.5 kbp范围内的ds RNA片段的携带率最高,为35.7%。其次为Bd CV1的基因组ds RNA,携带率为29.2%,然后是两条～2.0 kbp ds RNA和Bd RV1的基因组ds RNA。这些ds RNA片段在不同菌株中共存在29种不同的组合模式,表明不同病毒在B.dothidea中可能存在多种复合侵染模式。对不同省份的菌株中ds RNA片段分别进行统计,发现来源于不同梨产区的B.dothidea菌株携带的ds RNA病毒种类存在较大的差异。为进一步明确来源于我国梨的B.dothidea携带病毒的多样性,从中选取156个菌株进行宏病毒组分析。结果显示,共发现有13个科72种病毒,其中55种为新型病毒。这些病毒中+ss RNA病毒有52种,ds RNA病毒19种,-ss RNA病毒仅1种。基于Rd Rp的氨基酸序列对其中的41种病毒进行系统发育分析,发现共有36种病毒属于已知的病毒科,包括Narnaviridae、Botourmiaviridae、Alphaflexiviridae、Deltaflexiviridae、Partitiviridae、Totiviridae、Ambiguivirida、Fusariviridae和Bipartitiviridae;还有5种病毒尚不能确定其分类地位,为此建议基于这些病毒成立Botourmiaviridae下的一个新的病毒属Botryosoulivirus和一个新的病毒科Mycobromoviridae以确立相关病毒的分类地位。本部分内容对B.dothidea菌株中的病毒多样性进行了系统研究,明确了这些菌株共携带有22种不同大小的外源ds RNA种类,这些ds RNA在不同菌株中存在29种不同的侵染模式,并发现来源不同梨产区菌株中携带的ds RNA病毒具有较大差异。此外,对部分菌株进行高通量测序进一步发掘了B.dothidea中的真菌病毒种类,研究共发现72种病毒,其中55种为新型病毒,并选取了其中的41种病毒序列进行系统发育分析,发现这些病毒可归类于10个病毒科下。2.葡萄座腔菌中鉴定的三种新病毒及其分子生物学特性通过对来源于辽宁梨的B.dothidea弱毒菌株L153中病毒种类的鉴定,发现该菌株携带有5种病毒,其中4种为+ss RNA病毒,分别是Botryosphaeria dothidea botrexvirus 1(Bd BV1)、Botryosphaeria dothidea narnavirus 2(Bd NV2)、Bd NV3和Bd NV4,另外一种为ds RNA病毒Botryosphaeria dothidea partitivirus 1(Bd PV1)。其中Bd BV1包含两条+ss RNA基因组,长度分别为5033 bp和1063 bp。RNA1包含4个开放阅读框(ORF1-4),ORF1能够比对到甲型线型病毒科(Alphaflexiviridae)成员的复制酶,ORF3能够比对到酵母(Cryptococcus neoformans)的假定蛋白,其它ORF则比对不到任何同源蛋白信息。对ORF1进行保守结构域比对分析发现存在有3个保守结构域,分别为病毒的甲基转移酶(Vmethyltransf)、病毒的解螺旋酶(Viral＿helicase)和依赖RNA的RNA聚合酶(Rd Rp)。RNA2包含一个开放阅读框,编码病毒的外壳蛋白(CP)。值得注意的是RNA2链的3′末端248个核苷酸与RNA1相应位置的末端序列完全一致,其中包含了RNA1的ORF4部分和非翻译区,目前在真菌病毒中尚无这种结构的报道。基于复制酶氨基酸序列的系统发育分析表明Bd BV1与Botrexvirus属中的单一病毒Bot VX聚在同一分支,可能为该属的一个新成员。但Bd BV1具有与其相近的真菌病毒Bot VX差异较大的基因组结构。Bd BV1-CP序列与其相近病毒均存在一个典型的盐桥保守结构域,该结构域是侵染植物的弯曲杆状病毒所特有疏水结构域。通过对菌株L153仅不携带Bd BV1的单孢后代菌株L153-29进行生物学特性进行研究,发现该菌株在菌落特征、菌丝形态和致病性方面较其母代菌株L153的异常状态均有较大的恢复,表明菌株L153的生长异常和弱毒特性主要与携带病毒Bd BV1有关。此外,对菌株L153中的病毒粒子进行电镜观察发现该菌株中携带有两种形态的病毒粒子,一种可能为Bd PV1的球形病毒粒子,另外一种是线型的病毒粒子。对这种线型的病毒粒子长度进行测量统计发现最长能达到5451.5 nm,这是B.dothidea线型病毒粒子的首次发现,也是截至目前发现的最长的病毒粒子。通过SDS-PAGE检测发现菌株L153中的病毒粒子有5种结构蛋白,其中P35、P25和P15为未知蛋白。通过肽指纹图谱鉴定(PMF),发现P35为线型病毒粒子CP所编码。采用Bd BV1 RNA2编码的CP原核表达产物制备多克隆抗体进行免疫电镜观察的结果显示,线型病毒粒子周围富集有抗体,表明来菌株L153中的线型病毒粒子即为Bd BV1。从来源于山东梨的B.dothidea菌株MSD53中鉴定出一种单组分ds RNA病毒,暂命名为Botryosphaeria dothidea victorivirus 2(Bd VV2)。Bd VV2的基因组全长为5090 bp,包含两个开放阅读框,分别编码病毒的CP和Rd Rp。将该病毒的CP和Rd Rp进行比对分析,发现均与整形病毒科的成员具有较高的同源性,其中与Sphaeropsis sapinea RNA viruses 1(Ss RV1)的相应蛋白的同源性最高,分别为68%和60%。Bd VV2病毒粒子球形,直径约38 nm。基于CP和Rd Rp序列系统发育分析表明,Bd VV2为整形病毒科维多利亚病毒属的新种。从来源于江西梨的B.dothidea菌株G91中鉴定出一种新的+ss RNA病毒,暂命名为Botryosphaeria dothidea botourmiavirus 1(Bd BOV1)。Bd BOV1基因组全长2547bp,包含一个开放阅读框,可能编码病毒的Rd Rp。通过基因组全长比对分析,发现该病毒与新建立的Botourmiaviridae病毒科的成员具有较高的同源性。基于Rd Rp的系统发育分析,该病毒与Magoulivirus病毒属的Magnaporthe oryzae ourmia-like virus(Mo OLV)和Rhizoctonia solani ourmia-like virus(Rs OLV1)相聚最近,但又独立于Magoulivirus和Botourmiaviridae的其它属之外。表明Bd BOV1可能为Magoulivirus病毒属的新成员或者可能与其相近病毒属于一个新病毒属。