【摘 要】
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蛋白的分离纯化是发酵工程中的下游部分,在发酵工程中起着至关重要的作用。细胞分泌蛋白的同时还分泌蛋白酶,蛋白面临被降解的风险;传统的色谱法（如离子交换色谱,凝胶过滤、亲和层析等）流程复杂且非特异性吸附较强。固定相在蛋白质分离中发挥着重要作用,所以急需开发一种和蛋白相互作用的材料,以实现蛋白快速分离并保证蛋白活性。IMAC是目前最广泛的用于蛋白分离纯化的方法,此方法的优势在于NTA配基吸附量大,结合牢
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蛋白的分离纯化是发酵工程中的下游部分,在发酵工程中起着至关重要的作用。细胞分泌蛋白的同时还分泌蛋白酶,蛋白面临被降解的风险;传统的色谱法（如离子交换色谱,凝胶过滤、亲和层析等）流程复杂且非特异性吸附较强。固定相在蛋白质分离中发挥着重要作用,所以急需开发一种和蛋白相互作用的材料,以实现蛋白快速分离并保证蛋白活性。IMAC是目前最广泛的用于蛋白分离纯化的方法,此方法的优势在于NTA配基吸附量大,结合牢固,适用度广。但往往受到粒径和修饰方法的限制。“包埋”是一种有利于保护酶活的方法,其原理与自然细胞中将酶与有害基质隔离的机理相似。本文将接枝双键的NTA与丙烯酰胺（AM）光交联共聚得到分离纯化蛋白的AM-NTA水凝胶,利用微流控技术将酵母细胞包埋于微凝胶中,并且验证了载细胞AM-NTA微凝胶直接从发酵液中分离纯化得到目标蛋白,实现发酵分离一体化。首先探索了分离纯化蛋白的AM/NTA水凝胶的制备。（1）首先选择海藻酸钠作为接枝NTA的材料。将产物的配基密度与商业化Ni-NTA QZT 6FF对比,结果显示其NTA密度仅为商业化的0.458%。第二种方法利用琥珀酰亚胺与氨基的反应将NTA接枝双键,随后分别与聚乙二醇而丙烯酸酯（PEGDA）/丙烯酰胺（AM）共聚生成水凝胶。结果显示AM-NTA水凝胶表现出更优异的回收蛋白的能力,最佳回收的咪唑浓度为200m M。（2）探究了AM/NTA水凝胶的不同投料比的对于成胶性能、Ni2+结合量、孔隙率、流变性能的影响。结果表明摩尔浓度（M）一定,随NTA组分增多,成胶性能下降,储能模量（G’）降低,水凝胶网络密度愈疏松;AM/NTA水凝胶的Ni2+结合量随NTA组分增多而变大,AM-NTA水凝胶体积一定时,4-3组（M=4,AM:NTA=1:2）的Ni2+结合量最大,高达32.53±0.03μmol/m L。其次探究了酵母细胞在AM-NTA水凝胶中的增殖与蛋白分离纯化效果。（1）通过调控各实验因素探究细胞增殖最佳条件,结果表明光照时间30s,MBA=0.4%M总,3-3组（M=3,NTA/AM=1:2）细胞活力最高。（2）进一步将载细胞琼脂糖微粒负载到微球中,结果表明二者比例1:1时,细胞在3day内连续增殖;回收的目标蛋白为0.05±0.03 mg/m L,且纯度高于商业化填料。综上所述,本文成功制备了载细胞的一步法分离纯化蛋白水凝胶,并且纯度高于商业化产品。为快速分离纯化提供了新策略。
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