目的：　　本文主要研究了临床上最为常见的重要致病菌肺炎克雷伯菌中β-内酰胺酶基因的分布及耐药性分析。采用新一代高通量测序技术分析240株肺炎克雷伯菌混合基因组中已知的β-内酰胺酶基因的分布，随后逐株筛选肺炎克雷伯菌中出现的blaKPC、 blaCARR、blaLEN及blaKLUC四种β-内酰胺酶基因。blaKPC基因是碳青霉烯酶基因，能水解包含碳青霉烯类抗生素在内的几乎所有β-内酰胺类抗生素，是现阶段肺炎克雷伯菌中主要研究的β-内酰胺酶耐药基因之一;blaCARB基因和blaLEN基因在肺炎克雷伯菌中报道较少;blaKLUC基因只在阴沟肠杆菌和大肠杆菌中发现，还未在肺炎克雷伯菌中发现。筛选出阳性菌株后通过克隆表达实验，药敏实验、接合转移实验和S1-PFGE实验，分析本实验中出现的β-内酰胺酶基因的分子流行病学趋势、耐药性功能及定位。　　方法：　　1.用碱裂解法提取从温州医科大学附属第一医院临床分离得到的240株肺炎克雷伯菌基因组DNA，等量混合后，将混合基因组DNA使用第二代Illumina/solexa测序技术进行高通量测序。　　2.从Genbank、ARDB(Antibiotic resistance database)数据库及文献中收集β-内酰胺酶基因。　　3.将测序所得到的短序列用一系列的生物信息学工具比对定位到收集到的β-内酰胺酶基因的参照基因序列上，检测出测序的肺炎克雷伯菌所包含的β-内酰胺酶基因的类型及丰度。　　4.根据筛查到的β-内酰胺酶基因，选取blaKPC、 blaCARB、blaLEN及blaKLUC基因，设计引物。以上述240株肺炎克雷伯菌每株菌的单独基因组作为模板，利用PCR技术扩增β-内酰胺酶基因，分离出含有β-内酰胺酶基因的阳性菌株。　　5.通过琼脂稀释法检测携带β-内酰胺酶基因的肺炎克雷伯菌原始菌株对临床常用β-内酰胺类抗生素的最低抑菌浓度(MIC)。　　6.功能验证:扩增带有EcoRⅠ和SalⅠ双酶切位点的β-内酰胺酶基因，与pET-28(a)构建原核表达载体，转化入E.coli BL21实现表达，验证本实验中筛选出来的肺炎克雷伯菌所携带的β-内酰胺酶基因的耐药性功能。　　7.通过对携带β-内酰胺酶基因菌株的质粒进行PCR鉴定、质粒接合转移实验和对接合转移成功菌株进行S1-PFGE等实验来对本实验新发现的β-内酰胺酶基因新基因型进行初步的亚细胞定位。　　结果：　　1.从数据库收集到75条β-内酰胺酶基因。　　2.solexa测序结果和数据库收集到的β-内酰胺酶基因比对后，肺炎克雷伯菌中存在的β-内酰胺酶基因有blaCARB、blaKPC、blaKLUC、blaLEN、blaNDM、blaOKP-A、blaZ、blaDHA、blaSHV、blaTME、blaCTX-M-9群、blaCTX-M-1群和blaOXY。　　3.选取blaCARB、blaKPC、 blaKLUC及blaLEN这四个β-内酰胺酶耐药基因设引物，通过PCR及测序。在240株肺炎克雷伯菌中，筛选出携带blaKPC基因的9株，阳性检出率为3.75％;携带blaLEN基因的4株，阳性检出率为1.67％;携带blaCARB基因1株，阳性检出率为0.42％;携带blaKLUC基因的1株检出率为0.42％。其中有一株菌同时携带blaLEN、blaCARB和blaKLUC三个基因。　　4.通过琼脂稀释法检测携带β-内酰胺酶基因的肺炎克雷伯菌对不同β-内酰胺类抗生素药物的敏感程度。结果显示，携带blaK，C基因的9株肺炎克雷伯菌和同时携带blaLEN、blaCARB和blaKLUC三个基因的菌株KP1276比只携带blaLEN基因的菌株明显耐β-内酰胺酶类抗生素药物。而携带blaKPC基因的菌株又比同时携带blaLEN、blaCARB和blaKLUC三个基因的菌株以及只携带blaLEN基因的菌株更容易水解碳青霉烯类抗生素（亚胺培南和美罗培南）。　　5.通过克隆表达实验成功构建15株克隆菌:其中携带blaKLUC基因的1株，携带blaCARB基因的1株，携带blaLEN基因的4株，携带blaKPC基因的9株。说明blaCARB、blaKPC、blaKLUC及blaLEN基因与细菌的多重耐药性有关。　　6.接合转移实验得到了1株携带blaKLUC基因的接合子、3株携带blaKPC基因的接合子。通过检测16srRNA确认这四株菌均为大肠杆菌EC600。用琼脂稀释法对比接合子和原始菌以及受体菌E.coli EC600的药物敏感程度。发现对β-内酰胺类药物氨苄西林、头孢唑啉、哌拉西林和头孢吡肟，接合子比受体菌E.coli EC600高了5到9个耐药梯度。　　7.本次实验在肺炎克雷伯菌中发现了1株携带blaKLUC基因的菌株，这株菌还同时携带blaLEN基因和blaCARB基因。对这株菌进行克隆实验和接合转移实验说明blaKLUC基因与细菌的多重耐药性有关。对接合转移成功菌株E.coliEC600-blaKLUC-KP1276做S1-PFGE，结果显示KP1276成功转移一个质粒至EC600，可初步确定blaKLUC存在于质粒上。　　结论：　　1.肺炎克雷伯菌中稀有β-内酰胺酶耐药基因的低阳性检出率与高通量测序技术以及生物信息学技术得到的丰度图结果较为一致，这使我们能够在短时间内利用大规模基因组测序，来探索基因结构与病原菌耐药性的关系，对于致病菌中耐药基因的分布及新基因的发掘和功能研究起着极为有效的作用，为新药的研制与开发提供了新的思路。　　2.本次实验共筛选出9株携带blaKPC基因、4株携带blaLEN基因、1株blaCRB基因和1株携带blaKLUC基因的肺炎克雷伯菌，其中有一株有菌同时携带blaLEN基因，blaCARB基因和blaKLUC基因。　　3.成功构建克隆表达载体并对其进行药敏检测，确定发现的基因型确实是与细菌多重耐药性有关的。　　4.本次实验在肺炎克雷伯菌中发现了1株携带blaKLUC基因的菌株，这株菌还同时携带blaLEN基因和blaCARB基因。对这株菌进行克隆实验和接合转移实验说明blaKLUC基因与细菌的多重耐药性有关。对接合转移成功菌株E.coliEC600-blaKLUC-KP1276做S1-PFGE，结果显示KP1276成功转移一个质粒至EC600，可初步确定blaKLUC存在于质粒上。