第一部分结直肠癌浸润前沿细胞核β-eaten in表达与同时性肝转移关系的研究研究背景与目的结直肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一,在世界范围内结直肠癌发病率每年以2%的速度增长。尽管随着诊疗技术的不断进步结直肠癌患者预后有了很大改善,但病死率仍居高不下。结直肠癌患者病死的主要原因是局部复发和远处转移,结直肠癌最常见的远处转移脏器是肝脏。据文献报道,无肝转移结直肠癌患者五年生存率接近90%,而发生肝转移结直肠癌患者五年生存率仅为19%。结直肠癌患者在确诊时,有20%-40%的患者已发生肝转移,结直肠癌根治性手术后发生肝转移的患者达50%,结直肠癌死亡患者中有肝脏转移者比例占45%-71%。结直肠癌肝转移的早期预测及诊断对指导治疗,改善患者预后有重要的意义。人们做了大量工作研究影响直肠癌肝转移的危险因素。就组织病理而言,血管浸润、肿瘤浸润深度、肿瘤细胞低分化、淋巴结转移等是结直肠癌肝转移的危险因素；从分子生物学来看,已经证明与结直肠癌肝转移有关的生物分子有表皮生长因子(Epidermal growth factor, EGF)、肌动蛋白相关蛋白2 (Actin-related protein 2, Arp2)、转化生长因子a (Transforming growth factor-α, TGF-α、分化抗原簇44(Cluster of differentiation 44,CD44)和分化抗原簇10(Cluster of differentiation 10, CD10)等。肿瘤浸润前沿(Invasive tumor front, ITF)是指位于肿瘤与宿主组织或器官交界处最前沿的3-6层肿瘤细胞或分散的细胞团,研究肿瘤浸润前沿细胞的特点对于了解肿瘤的生物学特性、指导肿瘤治疗及评诂预后有十分重要的作用。结直肠癌浸润前沿表现为肿瘤细胞低分化,伴随上皮表型缺失以及获得间质表型,从而有利于肿瘤侵袭转移,这个过程即肿瘤细胞上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)。结直肠癌上皮间质转化的一个重要分子是β-连环素(β-catenin)。β-catenin是一种分子量为90kD多功能蛋白质,它与E-黏附素(E-cadherin)的胞浆端相连构成E-cadherin/β-catenin复合物,参与构成细胞间粘附连接,对于维持上皮的极性和完整性有重要作用；β-catenin又是Wnt信号途径的下游元件,在Wnt信号的刺激下,β-catenin的磷酸化受到抑制,使胞浆中β-catenin水平升高,β-catenin进入核内,调节靶基因的表达,当Wnt信号异常激活可引起细胞增殖分化的异常。文献报道,肿瘤细胞核β-catenin表达变化与结直肠癌肝转移有关。最近的研究表明,结直肠癌浸润前沿β-catenin mRNA表达明显增加,细胞核和细胞浆β-catenin表达亦伴随增加。上述资料提示,β-catenin在结直肠癌侵袭转移过程中起重要作用。基于以往的研究报道,我们认为结直肠癌浸润前沿细胞核β-catenin高表达可能在肿瘤浸润转移过程中发挥重要作用。我们观察了细胞核β-catenin在结直肠癌浸润前沿和肝转移灶的表达,明确二者有无联系。同时,我们还研究了结直肠癌浸润前沿细胞核β-catenin表达与临床病理特征的关系,明确结直肠癌浸润前沿细胞核β-catenin表达与同时性肝转移的关系。方法收集486例结直肠癌患者的原发癌组织和转移瘤标本以及相关临床资料,其中包括144例发生同时性肝转移患者。采用免疫组织化学法检测β-catenin在结直肠癌组织和肝转移灶的表达。采用x2检验比较结直肠癌浸润前沿细胞核β-catenin表达在有肝转移患者和无肝转移患者之间的差别；采用spearman相关分析分析结直肠癌浸润前沿细胞核β-catenin表达与肝转移灶细胞核β-catenin表达有无关系；x2检验分析结直肠癌浸润前沿细胞核p-catenin表达与临床病理特征的关系；单因素和logistic多因素回归分析分析结直肠癌肝转移的危险因素。结果1.所有结直肠癌患者组织标本中均能观察到β-catenin表达,在无肝转移的结直肠癌的浸润前沿和肿瘤中心β-catenin表达以胞膜型为主；在有肝转移的结直肠癌的浸润前沿β-catenin表达以胞核型为主。结直肠癌组织浸润前沿细胞核β-catenin过表达在有肝转移的结直肠癌患者较无肝转移的结直肠癌患者更明显(71.5%vs.29.3%；P<0.001).2. Spearman相关分析显示发生结直肠肝转移的患者结直肠癌浸润前沿细胞核β-catenin表达与肝转移灶细胞核β-catenin表达有显著相关性(r=0.499,P<0.001).3.x2检验结果显示结直肠癌浸润前沿细胞核β-catenin表达与年龄(P<0.001)、病理组织类型(P=0.01)、浸润深度(P<0.001)、淋巴结转移(P=0.021)、肝转移(P<0.001)及结直肠癌TNM分期(P<0.001)有关。4.x2检验显示,结直肠癌同时性肝转移与年龄(P=0.01)、肿瘤大小(P<0.001)、肿瘤分化程度(P<0.001)、浸润深度(P<0.001)、淋巴结转移(P<0.001)及浸润前沿细胞核β-catenin过表达(P<0.001)有关。5. Logistic多因素回归分析提示,年龄(P=0.003)、肿瘤大小(P<0.001)、浸润深度(P=0.001)、肿瘤分化程度(P=0.031)及浸润前沿细胞核β-catenin过表达(P<0.001)是结直肠癌肝转移独立危险因素。结论1.发生结直肠同时性肝转移患者结直肠癌浸润前沿细胞核β-catenin过表达更为明显。2.发生结直肠肝转移的患者结直肠癌浸润前沿细胞核β-catenin表达与肝转移灶细胞核β-catenin表达呈正相关关系。3.结直肠癌浸润前沿细胞核β-catenin表达与年龄、肿瘤病理类型、浸润深度、淋巴结转移、肝转移和TNM分期有关。4.结直肠癌同时性肝转移与年龄、肿瘤大小、肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移和浸润前沿细胞核β-catenin表达有关；年龄、肿瘤大小、肿瘤分化程度、浸润深度和浸润前沿细胞核β-catenin过表达是结直肠癌肝转移的独立危险因素。5.结直肠癌浸润前沿细胞核β-catenin过表达与同时性肝转移密切相关,细胞核β-catenin过表达可能是一个有价值的预测肝转移的预测因子。意义结直肠癌肝转移是影响结直肠癌患者预后的重要因素,结直肠癌肝转移的早期预测及诊断对指导治疗,改善患者预后有重要的意义。该研究是基于临床和病理资料来阐明结直肠癌浸润前沿细胞核β-catenin过表达与同时性肝转移关系的研究。本研究的临床意义在于,我们发现,结直肠癌浸润前沿细胞核β-catenin过表达与同时性肝转移密切相关,我们提供了一个可能有效预测结直肠癌肝转移的预测因子。第二部分CXCR4/SDF-1信号通路对结肠癌HT29细胞E-cadherin/β-catenin复合物表达的影响及其机制研究研究背景与目的结直肠癌患者主要的死亡原因是局部复发和肝脏转移,人们对结直肠癌肝转移的机制进行了大量研究。结直肠癌肝转移的步骤包括肿瘤细胞粘附性能的改变、肿瘤细胞脱离原发灶并降解细胞外基质、肿瘤细胞局部浸润及脉管浸润、肿瘤细胞在循环中播散和免疫逃逸、肿瘤细胞血管内栓塞、肿瘤细胞在新的微环境重新生长及肿瘤血管生成等。每一个步骤都涉及多种分子事件,研究这些分子事件有助于理解结直肠癌肝转移机制,并为结直肠癌肝转移的预防和治疗提供理论依据。目前对于肿瘤转移机制的解释有3种学说,即“种子与土壤”学说、“解剖-机械”学说和“信号或归巢”学说。“信号或归巢”学说认为肿瘤细胞高表达特异的趋化因子受体,宿主器官则表达其相应的趋化因子配体,肿瘤细胞借助趋化因子配体与其受体的特异性结合力,实现组织器官的特异性转移。“信号或归巢”学说最初用于解释造血干细胞特异性归巢于骨髓,2001年Muller等首次发现,人乳腺癌组织中和乳腺癌细胞系高表达趋化因子受体CXCR4,而在乳腺癌最常见的转移部位如淋巴结、肺、肝脏和骨髓等部位则高表达其配体基质衍生因子-1(Stromal cell-derived factor-1, SDF-1),并且从这些组织提取的蛋白对乳腺癌细胞有明显的趋化作用,说明SDF-1及其受体在决定乳腺癌转移部位上起着非常重要的作用。SDF-1属于趋化因子CXC亚家族,CXCR4为G蛋白偶联的跨膜受体蛋白超家族中的一员,是SDF-1的唯一受体。前已知超过23种人类的恶性肿瘤细胞有CXCR4表达,CXCR4/SDF-1生物轴在乳腺癌、恶性黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、食管癌等肿瘤侵袭转移过程中的作用也得到证实。近年来很多研究报道指出趋化因子SDF-1与其特异性受体CXCR4在结直肠癌的肝转移过程中发挥重要作用。E-cadherin是定位于细胞间粘附连接的一次跨膜单链糖蛋白,相邻细胞E-cadherin的胞外域可相互结合形成拉链样结构,介导同型细胞间连接。E-cadherin浆内部分通过α、β、γ-catenin与细胞骨架结合,构成cadherin-catenin复合物,介导细胞粘附和信号转导,参与调节组织发生和形态分化,对细胞识别、迁移、归类等行为发挥重作用。研究表明,E-cadherin/β-catenin复合物与结直肠癌的侵袭转移关系密切。我们前面的研究表明,β-catenin与结直肠癌同时性肝转移关系密切,基于我们的研究发现和以往对CXCR4/SDF-1信号通路及E-cadherin/β-catenin复合物与结直肠癌侵袭转移关系的研究,我们认为CXCR4/SDF-1信号通路与E-cadherin/β-catenin复合物之间可能存在联系。本研究检测了SDF-1对结肠癌HT29细胞系E-cadherin/β-catenin复合物表达的影响。同时,我们还检测了E-cadherin/β-catenin mRNA水平的变化及磷酸肌醇3激酶／蛋白激酶B(P13K/AKT)和β-catenin磷酸化变化,探讨CXCR4/SDF-1信号通路影响E-cadherin/β-catenin复合物表达可能的分子机制。方法1.MTT法检测SDF-1对结肠癌HT29细胞增殖的影响。2.Transwell体外侵袭实验检测SDF-1对HT29细胞侵袭能力的影响。3.免疫细胞化学法检测SDF-1对HT29细胞E-cadherin和β-catenin表达的影响。4.反转录PCR(RT-PCR)检测SDF-1对HT29细胞E-cadherin mRNA和β-catenin mRNA表达的影响。5.蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测HT29细胞PI3K/AKT和β-catenin磷酸化变化。结果1.SDF-1作用于HT29细胞48h后,各组增殖并无明显差异。72h后20ng/mL和40ng/mLSDF-1组HT29细胞增殖较对照组明显增加,增殖率分别为129%和135%,统计学上有显著性差异(P=0.034和P=0.026)。而预先用AMD3100处理过的HT29细胞,SDF-1促进增殖的作用不明显,单独用AMD3100处理的HT29细胞增殖与对照组无差别。2. SDF-1作用于HT29细胞24h后10ng/mL.20ng/mL和40ng/mL3组迁移细胞较对照组(92.3±12.4)均明显增加,迁移细胞数分别为149±13.3(P=0.041),161±13.5(P=0.023)和187.5±14(P<0.001)。预先用AMD3100处理过的HT29细胞侵袭能力无明显变化,单独用AMD3100处理的HT29细胞迁移细胞与对照组无差别。3.免疫细胞化学检测显示SDF-1作用48h后,20ng/mL组和40ng/mL组HT29细胞E-cadherin表达较对照组显著下降(P=0.044和P<0.001)。而预先用AMD3100处理过的HT29细胞,SDF-1作用后未见E-cadherin表达下降。单独用AMD3100处理HT29细胞E-cadherin表达亦未出现明显变化。RT-PCR分析显示,20ng/mL和40ng/mLSDF-1作用HT29细胞48h后,E-cadherin mRNA水平显著下降(P=0.033和P<0.001)。预先用AMD3100处理过的HT29细胞,SDF-1作用后未见E-cadherin mRNA表达下降,单独用AMD3100处理的HT29细胞E-cadherin mRNA表达亦未出现明显变化。4.免疫细胞化学检测显示,20ng/mL组和40ng/mL组SDF-1处理48h后HT29细胞的β-catenin表达均显著下降(P=0.031和P<0.001)。尽管预先用AMD3100处理过的HT29细胞经SDF-1作用48h后β-catenin表达亦有所下降,但差异不明显。单独用AMD3100处理的HT29细胞β-catenin表达亦未出现明显变化。RT-PCR分析显示,SDF-1作用48h后,20ng/mL组和40ng/mL组HT29细胞β-catenin mRNA水平均显著下降(P=0.037和P<0.001)。预先用AMD3100处理过的HT29细胞SDF-1作用后未见β-catenin mRNA表达下降,单独用AMD3100处理的HT29细胞β-catenin mRNA水平亦未出现明显变化。5. SDF-1 (20ng/mL)作用HT29细胞lmin后,PI3K/AKT和β-catenin即发生磷酸化变化,β-catenin磷酸化在第5min时明显增强,而PI3K/AKT磷酸化则在第15min时明显增强。β-catenin磷酸化高峰出现在第30min,之后明显的β-catenin磷酸化一直维持48h; PI3K/AKT磷酸化高峰出现在第15-60min,持续2h,之后逐渐减弱。分别用Ong/mL,5ng/mL,20ng/mL,40ng/mL和100ng/mL的SDF-1处理HT29细胞30min。结果显示,PI3K/AKT和β-catenin磷酸化与SDF-1浓度有关,随着浓度增高,二者磷酸化亦逐渐增强,100ng/mL处理处理HT29细胞30min时PI3K/AKT和β-catenin磷酸化最明显。6.应用AMD3100和LY294002分别阻断CXCR4/SDF-1信号通路和PI3K/AKT信号分子后发现,AMD3100能够阻断HT29细胞PI3K/AKT和β-catenin磷酸化,LY294002也能够阻断PI3K/AKT和β-catenin磷酸化。结论1. SDF-1能够促进人结肠癌HT29细胞的生长；2. SDF-1能够增强人结肠癌HT29细胞侵袭能力；3. CXCR4/SDF-1信号通路参与了诱导HT29细胞E-cadherin/β-catenin复合物表达下降；4. PI3K/AKT和β-catenin磷酸化及E-cadherin/β-catenin mRNA下调可能是SDF1诱导HT29细胞E-cadherin/β-catenin下调的重要原因；5.CXCR4/SDF-1信号通路引起HT29细胞β-catenin磷酸化是通过PI3K/AKT实现的,β-catenin是PI3K/AKT的下游效应因子。意义本研究通过研究CXCR4/SDF-1信号通路对HT29细胞E-cadherin/β-catenin表达的影响以及导致E-cadherin/β-catenin表达变化的机制,提出了一种影响E-cadherin/β-catenin表达变化及CXCR4/SDF-1信号通路促进HT29细胞侵袭转移的可能的分子机制。