论文部分内容阅读
目的:通过建立小鼠穿透性角膜移植模型研究自噬(autophagy)-IL-1β信号通路在角膜移植免疫排斥反应中的作用。方法:(1)构建小鼠穿透性角膜移植模型,并随机分为异系角膜移植组、异系角膜移植并雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)纳米胶束点眼组、异系角膜移植并3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)点眼组。通过裂隙灯观察并评估RAPA及3-MA对角膜移植植片生存的影响;通过苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)观察异系角膜移植组、异系角膜移植并RAPA纳米胶束点眼组、异系角膜移植并3-MA点眼组角膜植片的病理改变;于角膜移植术后2周左右分别从异系移植组、异系移植并RAPA纳米胶束点眼组、异系移植并3-MA点眼组中分离小鼠角膜,利用Western Blot分析角膜中自噬相关蛋白以及白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)表达水平变化。(2)体外分离骨髓并通过巨噬细胞集落刺激因子(Macrophage colony stimulating factor,M-SCF)诱导骨髓源巨噬细胞(Bone marrow derived macrophages,BMDMs)。在此基础上,分别用RAPA、3-MA预处理,然后给予脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)及三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)刺激,然后通过Western Blot分析巨噬细胞裂解液中自噬相关蛋白以及IL-1β表达水平的变化,通过酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测上清中IL-1β的含量。(3)分别利用NLRP3基因缺陷小鼠以及野生型(wild-type,WT)小鼠构建穿透性角膜移植模型。在此基础上,采用临床观察等手段评估NLRP3对角膜移植免疫排斥反应的影响;在角膜移植术后2周左右分别从NLRP3缺陷型小鼠及野生型小鼠中分离角膜,利用Western Blot分析角膜中IL-1β的变化;通过HE染色法观察角膜植片的病理变化;利用实时定量PCR(Real time PCR,RT-PCR)检测角膜中白细胞介素-17(interleukin-17,IL-17)的表达水平。结果:(1)小鼠角膜移植术后,异系移植组、RAPA纳米胶束点眼组、3-MA点眼组发生免疫排斥反应的平均时间分别为(16.83±1.21)d、(30.00±0.00)d、(12.63±3.42)d,P<0.05,差异有统计学意义。HE染色结果显示:与异系移植组相比,3-MA点眼组角膜植片明显混浊水肿,角膜基质中可见大量炎性细胞浸润;而RAPA纳米胶束点眼组角膜植片不水肿,角膜基质中炎性细胞少。上述结果提示RAPA可抑制角膜移植免疫排斥反应,3-MA可促进角膜移植免疫排斥反应。通过Western Blot发现:与异系移植组相比较,RAPA纳米胶束点眼组角膜植片中膜型微管相关蛋白轻链3(microtuble associated protein light chain 3,LC3)-II的表达量明显多于胞浆型的自噬相关蛋白LC3-I(LC3-I),自噬底物p62/SQSTM1蛋白的表达水平显著降低,提示RAPA纳米胶束点眼可增强角膜植片中的自噬作用;而3-MA点眼组角膜植片中LC3-II型蛋白的表达水平明显少于LC3-I型,并且自噬相关底物p62/SQSTM1蛋白的表达水平却明显增加,提示3-MA点眼可抑制角膜植片中的自噬作用。基于上述结果,我们推测,RAPA可通过诱导自噬抑制角膜移植免疫排斥反应,而3-MA抑制自噬则可促进角膜移植免疫排斥反应的发生。此外,我们通过Western Blot还发现:与未治疗组相比较,RAPA纳米胶束点眼组的角膜植片中成熟形式的IL-1β表达水平明显减少,而3-MA点眼组角膜植片中成熟形式的IL-1β的表达水平却明显增多,提示IL-1β可能在角膜移植免疫排斥过程中起关键作用。(2)我们通过BMDM模型发现:在LPS与ATP刺激条件下,经RAPA预处理的细胞裂解液以及培养上清中成熟形式的IL-1β含量显著降低,并伴随自噬相关底物p62/SQSTM1的表达水平明显下降;而经3-MA预处理的细胞裂解液以及培养上清中成熟形式的IL-1β的含量显著增加,并伴随自噬相关底物p62/SQSTM1的表达水平的明显增加。以上结果从细胞水平上进一步证实:RAPA可通过诱导细胞自噬抑制IL-1β的成熟,而3-MA则通过抑制自噬可促进IL-1β的成熟。(3)NLRP3炎症小体是介导IL-1β成熟的关键蛋白复合体,接下来我们通过NLRP3基因缺陷小鼠评估IL-1β对角膜移植免疫排斥反应的影响。我们发现:野生型小鼠和NLRP3基因缺陷型小鼠发生免疫排斥反应的平均时间分别为(17.25±5.42)d、(25.50±5.73)d,(P<0.05),差异有统计学意义。HE染色结果显示:野生型小鼠角膜植片明显水肿,角膜基质中可见大量炎性细胞浸润,而NLRP3基因缺陷小鼠的角膜植片不水肿,角膜基质中炎性细胞浸润明显减少。Real-time PCR的结果表明:与野生型小鼠相比较,NLRP3基因缺陷小鼠角膜植片中IL-17的表达水平明显下降。上述结果表明NLRP3基因缺陷可延缓角膜移植免疫排斥反应的发生。同时,Western Blot结果显示:与野生型小鼠相比较,NLRP3基因缺陷小鼠角膜植片中IL-1β成熟体的表达水平明显减少。而通过结膜下注射向NLRP3基因缺陷小鼠的角膜植片中回输IL-1β则可促进角膜移植免疫排斥反应的发生。基于上述结果,我们提出NLRP3可通过影响IL-1β的成熟参与角膜移植免疫排斥反应过程。结论:1.诱导自噬可以抑制角膜移植免疫排斥反应,并延长角膜植片存活时间;而抑制自噬则可显著促进角膜移植免疫排斥反应的发生。2.自噬可通过调节NLRP3炎症小体介导的IL-1β成熟参与角膜移植免疫排斥反应的病理过程。