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胃癌是最常见的消化道肿瘤之一。普遍认为胃癌的发生发展,是一个多步骤多因素的过程,涉及一系列复杂的分子机制。探究其发生发展中新的分子机制,对确定生物学靶标、干预癌变具有重要意义。近年来,研究表明非编码RNA在调控细胞增殖、分化、侵袭、转移等生物学功能中发挥重要作用。miRNA是一类长度20-24核苷酸的非编码单链小分子RNA,其5’端带磷酸基团,3’端带羟基。课题组前期通过文献复习和数据库分析,发现miR-129-5p在胃癌组织中表达较正常组织表达显著下调。miR-129-5p属miR-129家族,是前体miR-129-1和miR-129-2的5’端的成熟产物,为功能的主要体现者。既往研究表明,miR-129-5p在多种肿瘤里表达异常,对肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、转移等生物学行为都有影响。本研究着重探究miR-129-5p在胃癌增殖中发挥的作用及其深入的作用机制。在本研究中,我们先在新鲜胃癌组织及癌旁配对组织中检测miR-129-5p的表达情况,分析其与患者临床病理资料之间的相关性。在胃癌细胞株中检测miR-129-5p的表达水平,通过在胃癌细胞系中特异性地过表达miR-129-5p,观察其对胃癌细胞增殖能力的影响,同时运用生物信息学技术筛选miR-129-5p潜在调控的靶基因并进行验证和功能回复实验。对筛选到的重要靶基因,再进行深入的机制研究。研究内容第一部分:1、胃癌组织中miR-129-5p的表达及其与胃癌临床病理资料之间的相关性①在60对胃癌组织与配对正常胃组织中,通过实时定量PCR(qRT-PCR)检测miR-129-5p在癌和癌旁的表达情况;②结合胃癌患者临床病理资料,分析miR-129-5p表达水平与患者资料、肿瘤大小、分期等之间的相关性;⑤在4株胃癌细胞及1株正常胃粘膜上皮细胞中,应用qRT-PCR检测miR-129-5p在细胞中的表达情况。2、特异性过表达miR-129-5p mimic后对胃癌细胞增殖能力的影响①采用 Cell Counting Kit-8 试剂盒(CCK-8)观察 miR-129-5p mimic 过表达后对MKN45和BGC-823细胞增殖的影响;②采用 EdU(5-ethynyl-2’-deoxyuridine)实验检测 miR-129-5p mimic 过表达后对MKN45和BGC-823细胞中处于S期的细胞百分数影响;③采用流式细胞仪检测miR-129-5p mimic过表达后MKN45和BGC-823的细胞周期变化。3、特异性过表达miR-129-5p mimic后对裸鼠皮下移植瘤生长的影响通过慢病毒在BGC-823细胞系上构建miR-129-5p稳定过表达的胃癌细胞株将其与对照组胃癌细胞注射到裸鼠皮下,建立裸鼠皮下移植瘤模型。每隔3～5天观察一次,记录移植瘤生长情况,持续观察至35天。第二部分:1、miR-129-5p潜在靶基因的筛选及验证运用生物信息学技术(TargetScan、miRTar Base、miRDB、miRWalkk 等软件)预测miR-129-5p可能调控的下游基因,联合The Caner Genome Atlas(TCGA)中胃癌基因表达数据库,挑选出高表达的下游基因HOXC10,采用qRT-PCR、Western Blot、双荧光素酶报告基因系统验证miR-129-5p与HOXC10的调控情况。2、HOXC10在胃癌组织中的表达情况及其与miR-129-5p的表达相关性①在60对胃癌组织与配对正常胃组织中,通过实时定量PCR(qRT-PCR)检测HOXC10在癌和癌旁的表达情况,分析其与miR-129-5p的表达相关性;②在4株胃癌细胞及1株正常胃粘膜上皮细胞中,应用qRT-PCR检测HOXC10在细胞中的表达情况。3、稳定敲除HOXC10对胃癌细胞增殖功能的影响①采用Cell Counting Kit-8试剂盒(CCK-8)观察稳定敲除HOXC10后对MKN45和BGC-823细胞增殖的影响;②采用EdU(5-ethynyl-2’-deoxyuridine)实验检测稳定敲除HOXC10后对MKN45和BGC-823细胞中处于S期的细胞百分数影响;③采用流式细胞仪检测稳定敲除HOXC10后对MKN45和BGC-823的细胞周期影响。4、共转染miR-129-5p和HOXC10对胃癌细胞增殖功能的影响①采用 Cell Counting Kit-8 试剂盒(CCK-8)观察共转染 miR-129-5p mimic和HOXC10过表达载体后对MKN45和BGC-823细胞增殖的影响;②采用 EdU(5-ethynyl-2’-deoxyuridine)实验检测共转染 miR-129-5p mimic 和HOXC10过表达载体后对MKN45和BGC-823细胞中处于S期的细胞百分数影响;第三部分:1、HOXC10转录因子下游靶基因的筛选及验证采用ChIP-seq,筛选HOXC10转录因子下游潜在靶基因,根据前期功能实验和KEGG分析筛选到重要的靶基因CCND1,并通过qRT-PCR、Western Blot、ChIP-PCR、双荧光素酶报告基因系统进行结合验证。2、在HOXC10稳定敲除细胞系上过表达CCND1载体对胃癌细胞周期的影响采用流式细胞仪检测在HOXC10稳定敲除细胞系上过表达CCND1载体后观察对胃癌细胞周期的影响。3、在定制的组织芯片上对HOXC10蛋白及CCND1蛋白进行免疫组化分析,并做相关性研究及预后分析。对含有90对胃癌和癌旁配对组织的组织芯片进行疫组化染色,分别分析癌与癌旁中HOXC10蛋白和CCND1蛋白表达的差异并做两者的相关性研究和预后分析。研究结果:第一部分:1、miR-129-5p在胃癌组织中表达量明显降低,其表达水平主要与胃癌患者肿瘤大小相关① 60对新鲜冰冻胃癌及其配对正常胃组织,通过qRT-PCR发现miR-129-5p水平较正常胃组织显著下调(p<0.001);② miR-129-5p表达水平主要与胃癌患者肿瘤大小相关;③miR-129-5p在MKN45、BGC-823胃癌细胞株中表达量均相对较低,故后续在这两株胃癌细胞上过表达miR-129-5p mimic进行相应细胞增殖方面的功能学实验。2、特异性过表达miR-129-5p mimic后明显抑制胃癌细胞的增殖能力①在MKN45、BGC-823胃癌细胞株上过表达miR-129-5p mimic,并通过qRT-PCR检测进行了验证;②通过CCK8细胞增殖实验,发现与对照组相比,过表达miR-129-5p mimic后能显著抑制胃癌细胞的增殖(p<0.001)。①EdU结果显示,过表达miR-129-5p mimic的MKN45、BGC-823中S期的细胞百分数明显比miRNANC mimic组少(p<0.001)。④细胞周期结果显示,与对照组相比,过表达miR-129-5pmimic显著影响细胞周期,主要表现为G1/S期阻滞(MKN45:G1期增加,S期减少,p<0.01;BGC-823:G1期增加,S期减少,p<0.01);3、特异性过表达miR-129-5p mimic后明显抑制裸鼠皮下移植瘤的生长持续观察35天后,发现过表达miR-129-5p组移植瘤生长速度明显慢于对照组,分离瘤体后其大小和重量,过表达miR-129-5p组移植瘤的体积和重量均明显小于对照组(p<0.01)。第二部分:1、miR-129-5p在转录后水平调控HOXC10的表达①运用生物信息学技术预测到miR-129-5p可能调控的下游靶基因53个。②结合The Caner Genome Atlas(TCGA)中胃癌基因表达谱数据库,挑选出高表达的下游靶基因HOXC10。过表达miR-129-5pmimic可以在mRAN和蛋白水平使HOXC10的表达水平降低,通过双荧光素酶报告基因检测,验证miR-129-5p可以与HOXC10的3’UTR区结合,在转录后对HOXC10修饰降解。2、HOXC10在胃癌组织中高表达,其表达量和miR-129-5p成负相关①60对新鲜冰冻胃癌及其配对正常组织,通过qRT-PCR发现HOXC10水平较正常胃正常组织显著上调(p<0.001),HOXC10和miR-129-5p的表达存在负相关(r=-0.378,p<0.05);② HOXC10在MKN45、BGC-823胃癌细胞株中表达量均相对较高,故后续在这两株胃癌细胞上特异性敲低HOXC10进行相应细胞增殖方面的功能学实验。3、稳定敲低HOXC10明显抑制胃癌细胞的增殖能力①在MKN45、BGC-823胃癌细胞株上稳定敲除HOXC10,并通过免疫印迹法检测进行了验证得到稳转胃癌细胞株;②通过CCK8细胞增殖实验,发现与对照组相比,稳定敲除HOXC10后能显著抑制胃癌细胞的增殖(p<0.001)。③ EdU结果显示,稳定敲除HOXC10的MKN45、BGC-823中S期的细胞百分数明显比对照组少(p<0.001)。④细胞周期结果显示,与对照组相比,稳定敲除HOXC10显著影响细胞周期,主要表现为G1/S期阻滞(MKN45:G1期增加,S期减少,p<0.01;BGC-823:G1期增加,S期减少,p<0.01)4、共转染 miR-129-5p mimic 和 HOXC10 可以缓解 miR-129-5p mimic 对胃癌细胞增殖功能的抑制作用。①在MKN45和BGC-823胃癌细胞系中共转染miR-129-5p mimic和HOXC10过表达载体,CCK8细胞增殖结果显示,跟共转染miR-129-5p mimic和过表达空载体相比,过表达HOXC10载体,可以明显缓解miR-129-5pmimic对胃癌细胞增殖功能的抑制作用。② EdU结果显示,跟共转染miR-129-5pmimic和过表达空载体相比,过表达HOXC10载体,可以明显增加miR-129-5p mimic作用时胃癌细胞S期的细胞百分比数。第三部分:1、筛选并验证CCND1是转录因子HOXC10下游的一个重要的靶基因根据ChIP-seq结果,结合前期功能实验和的KEGG分析,筛选到CCND1可能是HOXC10转录因子下游发挥促进胃癌细胞增殖方面的一个重要的靶基因。qRT-PCR、Western Blot结果表明,敲低HOXC10可以在mRNA和蛋白水平使得CCND1的表达降低,同时ChIP-PCR结果显示,HOXC10蛋白抗体可以特异性把CCND1的启动子区域拉下来,构建的双荧光素酶报告基因实验也进一步证实了HOXC10可以与CCND1的启动子区结合。2、在HOXC10稳定敲除细胞系上过表达CCND1载体可以缓解G1/S期阻滞现象构建了 HOXC10稳定敲除的MKN45、BGC-823细胞系,细胞流式结果显示,跟过表达空载体相比,在HOXC10稳定敲除的细胞系上过表达CCND1载体,G1期细胞减少,S期增加,可以缓解HOXC10稳定敲低对胃癌细胞表现出的G1/S期阻滞现象。3、组织芯片的免疫组化结果显示,CCND1和HOXC10的表达存在中等相关性,且两者的表达情况和预后相关。90对定制的胃癌组织芯片结果显示,CCND1和HOXC10的表达存在中等相关性(r=0.349,p<0.01)。预后生存分析发现,HOXC10和CCND1的高表达的胃癌患者均表现为相对较差的预后。研究结论1、miR-129-5p在人胃癌组织中普遍低表达,其表达量与胃癌患者肿瘤大小相关。miR-129-5p可调控细胞周期从而影响到细胞增殖。2、miR-129-5p通过与HOXC10的3’UTR区结合,在转录后对HOXC10修饰降解,两者表达量在胃癌组织中存在中等负相关;HOXC10是miR-129-5p抑制胃癌细胞增殖中发挥重要作用的下游靶基因。3、CCND1是HOXC10转录因子在胃癌中发挥促增殖作用的一个重要下游靶基因,CCND1和HOXC10高表达的胃癌患者预后较差。