胶质瘤是最常见的中枢神经系统原发性肿瘤,高级别胶质瘤侵袭性强,临床预后差。虽然越来越多的先进技术应用于胶质瘤的诊断和治疗,但其中位生存期仍只有9-12个月[1]。随着近年来基因分子生物学的发展,从基因水平对胶质瘤进行防治已成为新的突破点[2]。因此,基于分子间相互作用的新型诊断和治疗策略的研究势在必行。Fms样酪氨酸激酶1(Flt1),即血管内皮生长因子受体1(VEGFR1),是以全长跨膜结构为特点的酪氨酸激酶受体。以往认为Flt1主要存在于血管内皮,通过与VEGF的结合,参与血管的形成、侧支循环的建立以及伤口的愈合等重要的生理过程[3]。同时,Flt1也是PIGF的受体之一,通过与PIGF的结合参与胚胎发育等过程。由于Flt1在血管形成方面的重要作用,其在肿瘤发生发展过程中的作用越来越受到人们的关注,关于抗VEGF/VEGFRs治疗方案已经进入三期临床试验阶段[4]。随着对Flt1的深入研究,发现在很多实体肿瘤细胞亦有Flt1的表达[5],这些细胞表达的Flt1不仅影响肿瘤的血管形成,对肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭等方面产生重要影响[6-8]。但高表达的Flt1对胶质瘤细胞的具体作用仍不清楚。Wnt/β-catenin是一种保守的信号通路,其在包括胶质瘤在内的许多肿瘤中发挥关键作用[9-12]。Wnt1接受信号激活后诱导GSK-3β磷酸化成p-GSK-3β,导致β-catenin在胞浆中聚积,随后转运至细胞核中,与转录因子TCF/Lef-1相互作用,进一步调节下游相关靶基因的表达,参与肿瘤的生长、迁移和血管生成等重要病理生理过程。有文献报道Flt1的激活可能是恶性胶质瘤进展中Wnt/β-catenin信号通路发挥作用的基础[13]。micro RNAs(miRNAs)是近年来研究的热点之一,其在肿瘤的发生发展过程中扮演重要角色。这些小分子非编码单链RNA通过直接或间接结合靶基因3’端非翻译区,导致靶m RNA的降解或低表达,从而发挥其抑癌或促癌的生物学作用[14]。miR-139-5p是今年来备受关注的miRNA之一,其已被发现在结肠癌、小细胞肺癌、肝癌等多种肿瘤中低表达,并对肿瘤的恶性生物学行为具有明确的抑制作用[15-17],但其在胶质瘤中的作用及相关机制并未明确。因此在本研究中,我们主要探讨了miR-139-5p对胶质瘤恶性生物学行为的影响及其相关机制。本研究主要分为四个部分:第一部分,运用实时定量PCR(RT-PCR)检测26例胶质瘤标本、12例正常脑组织标本和5种胶质瘤细胞系中miR-139-5p的表达水平,结果发现miR-139-5p在胶质瘤组织标本中的表达水平比正常脑组织显著降低。第二部分,主要探讨miR-139-5p对胶质瘤细胞恶性生物学行为的抑制作用。使用miR-139-5p模拟体转染U87和LN229细胞以提高胶质瘤细胞内miR-139-5p的含量。通过平板克隆形成实验和MTT法检测胶质瘤细胞的增殖能力;运用流式细胞仪PI染色法检测细胞周期;通过裸鼠荷瘤模型检测miR-139-5p对肿瘤体内生长的影响;通过Transwell实验检测胶质瘤细胞迁移和侵袭能力;通过血管拟态实验(VM)检测U87细胞的血管拟态现象;运用western blot检测上皮间质化(EMT)相关蛋白的表达。实验结果显示,过表达miR-139-5p可抑制胶质瘤细胞的增殖能力,并阻滞胶质瘤细胞周期于G0/G1期,从而抑制胶质瘤细胞的生长;同时miR-139-5p能有效抑制裸鼠体内肿瘤的生长;miR-139-5p能显著抑制胶质瘤细胞迁移和侵袭能力;同时,过表达miR-139-5p可以减少U87细胞血管拟态现象和胶质瘤细胞上皮间质化现象。第三部分,为探讨miR-139-5p对胶质瘤细胞恶性表型抑制作用的机制,我们检测了miR-139-5p的靶基因及其作用机制。通过对生物信息预测网站的检索,发现Flt1可作为miR-139-5p的潜在靶基因。随后,发现miR-139-5p模拟体转染组中Flt1的表达水平明显降低,免疫组织化学染色显示裸鼠移植瘤组织miR-139-5p治疗组中Flt1蛋白的表达量也明显降低,表明miR-139-5p能有效抑制Flt1基因的表达。荧光素酶报告实验显示miR-139-5p和PGL3-Flt1-3’UTR-wild质粒共转染能显著抑制荧光素酶活性,降低荧光强度,表明Flt1是miR-139-5p的直接靶点。为探索Flt1基因在胶质瘤中的作用机制,我们首先通过PCR和IHC我们发现Flt1在胶质瘤组织和细胞中高表达,可能起到促癌基因的作用。随后通过平板克隆形成实验和MTT法、PI染色法、Transwell实验、血管拟态实验和western blot等进一步观察Flt1对胶质瘤恶性生物学行为的影响,结果显示,敲低Flt1能有效抑制胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭、血管拟态和上皮间质化现象。为了更深入地探索miR-139-5p对胶质瘤细胞恶性行为的影响是否是通过抑制Flt1的表达来实现,我们构建了Flt1的过表达质粒(不含3’UTR)GV230-Flt1,并将其与miR-139-5p模拟体共转染U87和LN229细胞,观察胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭、血管拟态和上皮间质化现象。实验结果表明,过表达Flt1能逆转miR-139-5p对胶质瘤细胞恶性行为的抑制作用。第四部分,通过western blot进一步探索miR-139-5p/Flt1对胶质瘤细胞Wnt/β-catenin信号通路中相关蛋白含量的影响。实验结果显示敲低Flt1的表达,能下调Wnt1、β-catenin和p-GSK-3β蛋白的水平,同时上调GSK-3β蛋白的水平。因第三部分实验证实Flt1是miR-139-5p的直接靶点,故我们推测miR-139-5p能抑制Wnt/β-catenin通路的活性,随后通过western blot发现,过表达miR-139-5p可下调Wnt1、β-catenin和p-GSK-3β的含量,上调GSK-3β的含量。最后,通过GV230-Flt1与miR-139-5p模拟体共同转染U87细胞,发现Flt1同样能有效逆转miR-139-5p对Wnt/β-catenin通路的抑制效应,表明miR-139-5p可以通过下调Flt1的表达调节Wnt/β-catenin通路的活性。结论:我们的实验结果表明miR-139-5p在胶质瘤中低表达,能通过直接结合Flt1基因的3’UTR区抑制胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭、血管拟态和上皮间质化现象。同时,miR-139-5p能够调节Flt1介导的Wnt/β-catenin通路的活性。