论文部分内容阅读
脑缺血主要是由于脑血管内发生血栓、栓塞或其他原因导致脑供血不足而引起的脑梗死,它是导致人类残疾及死亡的头号杀手之一。到目前为止,除了t-PA溶栓外,尚无有效的治疗策略。在过去的几十年中,研究者也开展了大量关于神经保护剂的临床试验,但结果确是令人遗憾的。主要原因是,目前研究的针对单一靶点的药物与脑缺血过程的复杂性是相悖的。因此,还需进一步充分了解缺血病理过程的复杂机制并开发有效的、温和的、针对缺血不同过程能够进行多靶点治疗的神经保护剂。组胺是脑内一种重要的神经递质或调质,组胺能神经元胞体位于下丘脑结节乳头核,其神经纤维在全脑有着广泛的投射。目前为止,已发现四种组胺受体H1、H2、H3、H4,其中H1R-H3R受体主要分布于大脑。组胺能够通过H1R-H3R受体发挥多种神经调节作用。目前有研究表明脑内组胺与缺血后脑损伤有着密切的关系,在脑缺血动物模型中也发现了脑内组胺持续增高。同时更多研究表明,组胺合成酶组氨酸脱羧酶的抑制剂α-FMH可加重缺血晚期神经元的损伤,组胺前体物质组氨酸可减少大鼠局灶性缺血后的脑梗死体积。以上证据提示脑内组胺及其相关药物可能对缺血性脑损伤具有保护作用。但是,由于外源性组胺无法透过血脑屏障,且其H1、H2受体的激活与外周的炎症产生密切相关。因此,迫切希望找到能够促进脑内组胺能神经活性的药物以治疗脑缺血性神经损伤。组胺H3受体(H3R)是组胺能神经元的自身受体,能够负反馈参与调节组胺的合成与释放。已有研究表明组胺H3R拮抗剂可以通过促进组胺的合成和释放来治疗癫痫、睡眠障碍、学习与记忆障碍等中枢神经系统疾病。课题组前期研究也发现H3受体拮抗剂clobenpropit对于100μM NMDA诱发的神经元损伤有明显的保护作用；但是也有结果提示,H3受体激动剂对10μM NMDA诱导的细胞死亡也具有保护作用。因此,目前关于H3R对兴奋性损伤的作用及机制还不清楚。本课题旨在研究H3R及其拮抗剂对缺血性脑损伤的作用及机制研究,可能使得H3R成为缺血性脑损伤治疗的一个新靶点。组胺H3受体拮抗剂对缺血性脑损伤的神经保护作用及机制研究在离体实验中,在体外培养的大鼠皮层神经元上,缺氧缺糖／再灌(OGD/R)诱导离体缺血损伤模型。结果发现OGD/R后,组胺H3R表达显著上调。在转染的H3R高表达的HEK293细胞,加重了血清剥夺诱导的细胞死亡。组胺H3R拮抗剂thioperamide能够保护OGD/R诱导的神经元死亡,该保护作用可被组胺H3R激动剂immepip逆转。另外,thioperamide可显著降低OGD/R诱导的TUNEL阳性细胞凋亡以及cleaved caspase-3蛋白水平。在整体实验中,短暂性的小鼠大脑中动脉阻塞(tMCAO)建立整体动物缺血模型。结果发现,三种组胺H3R拮抗剂(thioperamide, clobenpropit, A331440)均可显著减轻tMCAO诱导的脑梗死体积。此外,H3R拮抗剂也可降低tMCAO诱导的细胞凋亡(TUNEL以及cleaved caspase-3)。另外,与WT小鼠相比,H3R基因敲除(H3R-/-)小鼠能够显著减少tMCAO诱导的脑梗死体积以及细胞凋亡。更多结果表明,组胺H3R拮抗剂对缺血性脑损伤的神经保护作用机制与其诱导的组胺上调无关。组胺H1R拮抗剂pyrilamine,组胺H2R拮抗剂cimetidine均不能逆转thioperamide对脑缺血的神经保护作用；给予组氨酸脱羧酶抑制剂α-FMH, thioperamide仍然具有神经保护作用；组氨酸脱羧酶基因敲除(HDC-KO)小鼠上,thioperamide依然表现显著的对脑梗死的保护作用。在体外培养的大鼠皮层神经元上,OGD/R诱导组胺H3R下游Akt/GSK3β磷酸化水平显著上调, thioperamide显著降低了OGD/R诱导的Akt/GSK3β磷酸化水平上调。GSK3β活性抑制剂LiCl (上调GSK3β磷酸化水平)逆转了thioperamide的对神经元的保护作用,表明H3R拮抗剂的神经保护作用可能与其下游的Akt/GSK3β信号通路的磷酸化抑制有关。进一步研究结果表明,thioperamide的对GSK3β的磷酸化抑制后还进一步导致对其下游mTOR/P70S6K的抑制作用,进而诱导自噬上调。在离体水平上,自噬抑制剂3-MA显著逆转了thioperamide的对神经元的保护作用；siRNA干扰自噬关键基因Atg7, thioperamide对神经元的保护作用显著降低；在自噬关键基因Atg5基因敲除的MEF细胞株上,thioperamide不具有保护OGD/R诱导的细胞损伤作用。在整体水平上,3-MA显著逆转了thioperamide的对脑梗死的减轻作用。更多研究结果表明,thioperamide的对自噬的上调的具体机制与跟H3R功能密切相关CLIC4蛋白有关。免疫共沉淀结果显示, OGD/R诱导H3R-CLIC4蛋白之间相互作用加强,thioperamide降低了两者之间的相互作用。使用多肽以及CLIC4的siRNA干扰方法模拟thioperamide的对H3R-CLIC4蛋白之间相互作用抑制作用,直接导致自噬水平的上调,因此,H3R-CLIC4蛋白之间相互作用的抑制参与了thioperamide的对脑缺血的保护作用的保护作用机制。