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日本沼虾(Macrobrachium nipponense)隶属甲壳纲(Crustacea)、长臂虾科(Palaemonidae)、沼虾属(Macrobrachium),广泛分布于各地的淡水中,由于其自身的环境适应优势和经济价值,使其成为了我国具有较大发展潜力的淡水养殖品种。我们前期研究证实,咪唑类物质KK-42处理能显著促进凡纳滨对虾(Penaeus schmitti)、日本沼虾幼虾的生长,但作用机制并不十分清楚。甲壳动物的生长与蜕皮密切相关,为了探索KK-42的作用机理,本文以日本沼虾幼虾为材料,采用生测方法,在进一步明确KK-42促生长效应的基础上,首先测定了幼虾蜕皮周期的时程,深入分析了3个与蜕皮有关的基因表达变化和蜕皮周期的关系,观察了表皮超微结构的变化,具体方法和结果如下:以水产基地自行繁殖的2月龄幼虾(体长1.2~2.0 cm)为材料,捕捞后暂养于流水养殖水槽,水温(26±1)℃,每天投喂2次,1周后用于实验研究。用1.95×10-4 mol/L的KK-42溶液(处理组)或不含KK-42溶液(对照组)浸润1 min,取出,一部分用于幼虾生长速率、蜕皮周期的测定;从剩余部分中选择处于不同蜕皮阶段的幼虾,分别在不同时间段取处理组和对照组的不同组织,用于RNA的提取、基因的克隆、几丁质酶(Chitinase)和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase,NAGase)m RNA的相对表达水平、相应的酶活性测定和表皮超微结构观察。在实验观察期间,KK-42处理组平均体质量均显著高于对照组,体质量增长率的升高出现在处理后的前2周。随着幼虾的生长,蜕皮周期的持续时间均趋于延长,在4个连续测定的蜕皮周期中,KK-42处理能明显缩短前2个周期的时程,分别从(8.70±1.07)、(9.81±0.43)d/周期缩短为(6.93±0.97)、(8.11±1.20)d/周期。首次从日本沼虾表皮组织中克隆出2个几丁质酶基因(M.nipponense Chitinase gene,MnChi)c DNA全长序列:MnChi-1和MnChi-3,其c DNA全长分别为1532 bp和1413 bp,各含有一个66 bp和26 bp的5’非翻译区,236 bp和247 bp的3’非翻译区,以及一个1230 bp和1140 bp的开放阅读框。其基因编码的蛋白质分别由410和380个氨基酸组成,预测其分子量为46.32 k Da和42.52 k Da,理论等电点(p I)为4.75和4.76。结构域分析表明,它们均含有一个信号肽、一个典型肽段催化域和糖基水解酶18家族保守域;氨基酸多重比对分析显示它们都缺泛S/T富集连接区和CBDs结构域。MnChi-1在表皮、肠道、尤其在肝胰腺组织高表达,其中,在表皮和肝胰腺中,蜕皮前期(D)表达量最高;Mnchi-3在表皮、肝胰腺、眼柄和肠道中均有表达,肠道组织最高,其周期表达模式与Mnchi-1类似。KK-42处理可显著上调蜕皮间期(C)表皮MnChi-1的表达,在第3、6和9h,其m RNA水平高于对照组10倍以上,酶活力同比提高2倍以上;KK-42处理对D期的影响相对较弱,该基因的表达水平及酶活性仅在12 h显著升高。KK-42对肝胰腺MnChi-1的影响类似。KK-42对表皮和肝胰腺MnChi-3转录及酶活性水平的影响与MnChi-1相似,显著的诱导作用主要发生在C期。首次从日本沼虾表皮中克隆出MnNAGase(M.nipponense NAGase,MnNAGase)c DNA全长序列,全长2536 bp,ORF长度为1854 bp,5′UTR为382bp,3′UTR为300 bp,预测蛋白的理论分子量为69.72 k Da,等电点为(PI)5.43。编码白617个氨基酸,结构域分析显示,它具有一个信号肽,一个糖苷水解酶20家族保守域,9个催化结构域特征保守位点,该段保守域氨基酸序列与凡纳滨对虾和中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)的相似度90.4%。该基因在表皮中的周期表达D期最高。KK-42处理可以显著上调C期表皮MnNAGase m RNA的表达,处理后3 h快速升高,6 h达到峰值,同比增加4倍以上(P<0.01);酶活性呈类似的变化趋势。KK-42对D期表皮MnNAGase的上调效应较弱,仅在处理后6 h,转录量明显升高,而酶活性在3、6和9 h均显著高于对照组。表皮上皮细胞层是蜕皮激素作用的靶组织,鉴于KK-42对C期Chitinase、NAGase活性及其基因表达显著的调节效应,采用透射电镜观察了分泌此酶的上皮细胞超微结构在C期的变化。结果显示,C期为单层假复层上皮细胞,扁平、排列规则;KK-42处理后9 h,上皮细胞延伸变长,多种细胞器如高尔基体、线粒体、粗面内质网、核糖体等大量出现。结论:KK-42处理能显著促进日本沼虾幼虾的生长和缩短其蜕皮周期;明显上调表皮和肝胰腺MnChi-1、MnChi-3和表皮MnNAGase的表达及酶活力;可以激发上皮细胞层的细胞活性,可能加速了多种酶的合成分泌和运输,进而加快了旧表皮的降解。这可能是KK-42缩短幼虾蜕皮周期的机制之一。