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转基因动物研究开始于上个世纪七十年代末,是一项能对家畜基因组进行修饰的有效技术,对改进畜牧业生产效率有重大的作用。目前转基因技术有原核注射法、精子介导法、逆转录病毒感染法和体细胞移植法等。将精子载体转基因法(SMGT)与单精注射(ICSI)结合制备转基因动物是一种新的转基因技术,研究历史较短,但其可行性和高效性已在多个物种得到试验证实。BAC作为转基因载体,可携带的基因包括上下游调控序列,可以和转录酶、转录因子等作用,转基因将能遵守基因固有的表达机制。所以将ICSI-SMGT技术与BAC转基因技术相结合制备转基因猪,为我们今后制备大片段转基因猪提供了新方法,具有广阔的应用前景。为成功制备转基因猪胚胎,本课题将从猪卵母细胞延迟保存与体外培养和以单精注射技术与BAC载体技术相结合为目标的两个方面进行研究。第一方面,建立猪卵母细胞体外延迟保存体系,拟设计先将卵母细胞分别放入TCM199(含HEPE)、PBS缓冲液(无Ca2+和Mg2+)和DMEM低糖培养基中37℃保存6-8h后转入成熟培养液与瞬时放入成熟培养液的对照组作比较,统计分析试验组之间成熟率,卵裂率和囊胚率的差别。其中对照组成熟率为78.190%,卵裂率为55.87%和囊胚率尾12.23%;TCM199试验组成熟率为76.25%,卵裂率为55.00%和囊胚率为12.12%；PBS试验组成熟率为49.00%,卵裂率为22.00%和囊胚率为2.27%；DMEM试验组成熟率为47.50%,卵裂率为20.50%和囊胚率为2.43%。比较结果发现TCM199试验组与对照组无显著差异,进而将TCM199试验组的胚胎进行胚胎移植,母猪受孕后产下11头小猪,小猪健康状况良好,体貌特征与自然受孕分娩的小猪无差异,所以TCM199(含HEPE)可以作为猪卵母细胞体外延迟保存液。为完善体外延迟保存体系,确立更好的延迟保存条件,设计将卵母细胞放入TCM199(含HEPE)后分别在4℃、25℃和37℃中保存6-8h后转入成熟培养液,统计分析各试验组之间成熟率,卵裂率和囊胚率的差别。其中4℃试验组成熟率为19.00%,卵裂率为9.5%和无囊胚；25℃试验组成熟率为33.00%,卵裂率为15.00%和无囊胚；37℃试验组成熟率为76.50%,卵裂率为54.50%和囊胚率为13.76%。比较结果得出37℃为理想的体外延迟保存温度。这一研究为实现卵母细胞发育初始时间的可控性提高可能。第二方面,为实现单精注射技术与BAC载体技术相结合制备转基因猪胚胎的目标。需要利用ICSI技术成功制备出猪胚胎。首先将精子以工作3s,间隔3s,功率3w总计60s的参数进行超声波断尾。再利用ICSI技术将精子注入卵母细胞并以170V,901μS条件下电激活受精卵,最后观察胚胎的发育状况。为实现成功制备大片段转基因猪胚胎提供了技术基础。本研究建立了体外延迟保存猪卵母细胞的体系,并建立一种以单精注射为基础,适用广、高效的导入外源基因的转基因技术,并通过ICSI技术向卵母细胞内导入大片段外源基因,制备转基因猪胚胎。