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猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起的以仔猪呼吸障碍和母猪繁殖障碍为主要临床症状的重要传染病。PRRSV于1996年在我国首次报道,对我国养猪业造成巨大经济损失。2012年美国报道了1-7-4毒株（NADC34-like PRRSV）大流行事件,被描述为一场母猪群中的“流产风暴”。2020年美国又报道了RFLP 1-4-4 Lineage1C PRRSV变异株疫情。我国于2017年首次发现NADC34-like PRRSV,并在2019年被认为是中国潜在的流行毒株。了解NADC34-like PRRSV毒株在我国的最新流行情况,鉴定其致病性具有重要意义。抗原表位一直是PRRSV研究的热点,鉴定国内最新流行毒株的抗原表位可以为抗体试剂盒和DIVA疫苗研制提供基础。本研究对2020～2021年间,来自全国14个省、市、自治区的828份疑似感染PRRSV的临床病料进行RT-PCR检测。检测结果显示,PRRSV阳性样品数量为433份,阳性率约为52.29%,其中NADC34-like PRRSV样品数量为82份,近年来该类毒株迅速传播,2021年,NADC34-like PRRSV在阳性总数的占比已经达到28.6%,已经成为中国部分地区的主要流行毒株之一。基于ORF5基因遗传演化分析发现,所有新发NADC34-like PRRSV均属于sublineage 1.5。为了更好的了解我国新发NADC34-like PRRSV与全球sublineage 1.5毒株的关系,本研究收集全球所有sublineage 1.5毒株ORF5基因序列作为参考构建进化树,结果表明流行于我国的NADC34-like PRRSV未形成独立分支,而是嵌入到美国sublineage 1.5分支中。因此,现阶段流行于中国的NADC34-like PRRSV不仅来自于较早毒株的传播,同时存在持续输入和独立进化的情况。本研究选择15份NADC34-like PRRSV阳性样品进一步完成了全基因组测序。基于全基因组序列遗传演化分析发现,新发NADC34-like PRRSV属于sublineage 1.5或sublineage 1.8,这预示着新发重组毒株的出现。重组分析结果显示15个获得全基因组序列的毒株中有6个发生了重组,重组模式复杂多样,没有发现明显的重组热点,BLAST分析发现NADC34-like PRRSV已经与中国本地流行的HP-PRRSV-like PRRSV和NADC30-like PRRSV发生了重组,并且新发重组毒株出现的时间与NADC34-like PRRSV阳性比例迅速上升的时间相吻合,因此新发重组毒株的出现可能是NADC34-like PRRSV快速流行的原因。推导氨基酸序列比对发现多数新发NADC34-like PRRSV在Nsp2区域具有与IA/2014/NADC34一致的100 aa连续缺失,部分毒株与NADC30株的缺失模式一致,这与重组分析结果相符,同时新发NADC34-like PRRSV在GP5线性抗原区域内存在大量氨基酸突变。未重组的NADC34-like PRRSV毒株同源性比对发现该类毒株的基因组同源性下降,NADC34-like PRRSV正在快速变异。在2020年10月以及次年4月,RFLP 1-4-4 lineage 1C PRRSV变异株引起了两次大范围的PRRS疫情,对美国当地养猪业造成严重危害。为了解该类毒株与中国当前流行PRRSV的关系,本研究通过序列分析发现,美国RFLP 1-4-4 lineage1C PRRSV变异株与我国NADC34-like PRRSV属于同一亚型分支（sublineage 1.5）,它们在Nsp2区域均具有相同的100个氨基酸连续缺失的分子特征。美国1-4-4 lineage1C PRRSV变异株是以NADC34-like毒株IA14737-2016为母本毒株,IA/2014/NADC34和NADC30病毒株提供重组片段的重组病毒。同时发现中国NADC34-like毒株HLJZD22-1812与美国1-4-4 lineage1C PRRSV变异株具有类似的重组模式、相同的Nsp2缺失特征、相同的1-4-4 ORF5 RFLP模式。但二者的同源性不足90%,这与美国从业者描述的谱系内高同源性不符,它们并不是由同一毒株演化而来。因此我国目前还未发现1-4-4 lineage1C PRRSV变异株,但时刻警惕RFLP 1-4-4 Lineage 1C PRRSV变异株的输入十分重要,避免该类毒株对我国养猪业造成损失。美国流行的NADC34-like PRRSV具有非常复杂的致病性,因此确定我国新发NADC34-like PRRSV致病性十分必要,同时还为后续的实验制备所需的PRRSV阳性血清。本研究对获得全基因组序列的15个NADC34-like PRRSV阳性样品进行病毒分离,最终成功利用Marc-145和Primary alveolar macrophages（PAM）细胞分离了LNTZJ1341-2012株。本研究选取了8头2月龄SPF仔猪,随机分为两组,其中攻毒组5头,对照组3头,选取LNTZJ1341-2012株PAM三代毒,对攻毒组仔猪以1×10~5TCID50/ml分别滴鼻（2 ml）和颈部注射（2 ml）共4 ml病毒培养上清。对照组仔猪以同样的方式注射1640培养基。实验过程中每日观察猪只临床症状并测温,在攻毒后的0 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d、17 d和21 d对猪只采血,在7 d、14 d和21 d称重记录,计算平均日增重,21d后,将所有仔猪安乐死,采集各脏器组织2份,用于确定组织病毒载量和组织病理学检测。实验结果显示,LNTZJ1341-2012攻毒组仅部分猪只出现食欲减退、精神萎靡和咳嗽等典型的PRRSV临床症状。同时部分猪只（2/5）出现了持续两天的一过性发烧,血清抗体在7～10 d转阳,平均日体重增长与对照组未出现明显差异,攻毒组所有仔猪在肺脏、颌下淋巴结和扁桃体中检测到较高的病毒载量,其中扁桃体的病毒载量最高。LNTZJ1341-2012引发较高的病毒血症,且持续时间长达21天以上。部分猪只肺部出现少量实变,同时颌下淋巴结出现出血点。组织病理学检测发现攻毒组猪只肺部出现广泛性炎性细胞浸润伴肺泡上皮细胞增生,肺泡膈中等程度增宽,同时颌下淋巴结副皮质区局部散在出血。综上所述,LNTZJ1341-2012株能够对部分猪只引起典型PRRS特征,对仔猪具有温和的致病性。筛选NADC34-like PRRSV抗原表位,对于指导抗体检测试剂盒研发,标记疫苗的构建具有重要意义。本研究首先将LNTZJ1341-2012株阳性血清预处理,去除血清与酵母细胞间的非特异结合。随后大量扩增LNTZJ1341-2012株的ORF1a和ORF2～7片段,并利用DNase I将其随机酶切消化为50～250 bp的DNA小片段。再连接到酵母展示载体p CTCON2中,将连接产物电转化克隆到DH5α感受态中,获得酵母随机展示文库。经验证文库质量良好,可以完全随机覆盖ORF1a和ORF2～7片段。提取文库质粒电转入EBY100酵母感受态中并诱导表达,使用预处理后的LNTZJ1341-2012阳性血清对其染色,利用流式细胞术分选阳性酵母,经过3轮富集后提取酵母质粒转化到DH5α,并挑取单克隆测序。最终在LNTZJ1341-2012株的ORF1a和ORF2～7上分别筛选出A1（Nsp1 150～191位aa）、A2（Nsp2 484～522位aa）、A3（Nsp2 675～713位aa）和A4（Nsp7β0～96位aa）;B1（GP3 3～45位aa）、B2（GP3 47～100位aa）、B3（GP5 132～174位aa）和B4（M 0～41位aa）共8个抗原表位。最后将获得的8个表位重新转入酵母并诱导其表面展示表达,通过流式分析验证其抗原性,结果显示,A1、A2、A4、B1和B2共5个表位具有较强的抗原性,具有成为DIVA疫苗标记位点和开发抗体检测试剂盒的潜力。综上所述,2020～2021年NADC34-like PRRSV已经成为我国部分地区的主要流行毒株之一,中国目前流行的NADC34-like毒株不仅来源于较早毒株传播,同时存在持续输入和单独的进化轨迹。本研究首次发现NADC34-like PRRSV已经与中国本地毒株发生重组并展现出复杂的重组模式。美国RFLP 1-4-4 lineage1C PRRSV变异株与我国NADC34-like PRRSV属于同一亚型分支（sublineage 1.5）。我国已分离到与其具有相同特征的NADC34-like PRRSV,但尚未发现与美国lineage1C变异株基因组序列高度同源的PRRSV。LNTZJ1341-2012株能够对攻毒组部分猪只引起典型PRRS症状,对仔猪具有温和的致病性。本研究首次利用酵母表面展示技术构建了PRRSV的ORF1a和ORF2～7抗原文库,并诱导其展示于酵母表面。利用流式细胞分选技术筛选并鉴定了5个抗原性较强的抗原表位,上述内容不仅对了解我国现阶段PRRSV的流行情况,指导PRRSV防控具有重要意义,还为PRRSV抗体检测试剂盒和DIVA疫苗开发奠定了基础。