1、目的与意义中药饮片的应用已有数千年的历史,为保障人民健康做出了重大贡献。但随着科学技术的进步,人民群众生活水平的提高,中药饮片煎煮麻烦、服用不便、质量不稳定、卫生状况差等缺点严重制约了中医临床的发展。20世纪90年代,超微粉碎技术成功应用于中药材加工,它以细胞破壁为目的,现已对400多种常用中药材制备成中药超微饮片。中药材经超微粉碎后,有利于药物有效成分的溶出,提高了药效,从而可以减少药材用量。由于细胞破壁后有效成分的快速大量释出,超微饮片欲应用于临床,必须要重新确定其使用剂量。目前,超微饮片临床用量与疗效关系研究不够明确。而中药复方是临床治疗疾病的主要形式,故对中药复方超微饮片的量效关系研究更有意义。基于以上目的,本项目选取小柴胡汤、葛根芩连汤2个经典复方为代表,对其超微饮片与传统饮片从化学成分及药效学两方面进行对比研究,为中药超微饮片替代传统饮片应用于临床提供科学依据。2、实验方法2.1超微饮片与传统饮片化学成分对比研究取超微饮片各样品少许,制成临时水装片,显微镜下测量粒径大小并观察细胞破壁情况。采用薄层色谱法对小柴胡汤黄芩苷成分及葛根芩连汤葛根素、盐酸小檗碱及黄芩苷3种化学成分进行定性鉴别；测定并比较超微饮片与传统饮片水溶性浸出物重量。采用紫外分光光度法测定不同溶剂量(5倍,10倍,20倍)小柴胡汤总黄酮及葛根芩连汤黄连总生物碱溶出量(mg.g-1)并作比较；比较相同溶剂量(20倍)、不同浸泡(或煎煮)时间总黄酮及黄连总生物碱溶出量。采用高效液相色谱法(HPLC)测定小柴胡汤中黄芩苷、葛根芩连汤中葛根素溶出量并作比较；测定相同溶剂量、不同浸泡(或煎煮)时间黄芩苷及葛根素溶出量并作比较。2.2超微饮片与传统饮片药效学剂量对比研究采用小鼠免疫性肝损伤模型观察小柴胡汤超微饮片与传统饮片对小鼠肝脏、脾脏、胸腺脏器指数,血清ALT与AST活性及肝脏病理改变的影响；采用MTT比色法观察两种饮片对免疫性肝损伤小鼠脾淋巴细胞增殖的影响,比较超微饮片与传统饮片药效学剂量相关性。采用小鼠小肠炭末推进实验与体外抑菌实验比较葛根芩连汤超微饮片与传统饮片药效学剂量相关性。3、实验结果3.1超微饮片与传统饮片化学成分定性定量分析结果3.1.1超微饮片粒度检测显微镜下可见超微饮片破壁细胞占视野的95%以上,颗粒直径一般2-30μm。除个别石细胞、木纤维等可见完整细胞外,其余均无完整细胞。3.1.2超微饮片与传统饮片薄层色谱鉴别在相应标准对照品相同位置上,超微饮片、传统饮片均出现相同斑点,且超微饮片较传统饮片斑点更明显；阴性对照品相同位置未见斑点。实验结果提示,中药材经超微粉碎后化学成分没有改变,保持了原药材药效学物质基础。3.1.3超微饮片与传统饮片水溶性浸出物量比较在相同条件下,小柴胡汤超微饮片的水溶性成分溶出量显著多于传统饮片(P<0.01),约为传统饮片的2倍；葛根芩连汤超微饮片水溶性浸出物是传统饮片的1.5倍。实验结果表明,中药材经超微粉碎后,可以增加水溶性成分的溶出量,从而显著地提高了浸膏得率。3.1.4小柴胡汤超微饮片与传统饮片总黄酮、黄芩苷溶出量测定在相同溶剂量条件下,超微饮片总黄酮、黄芩苷溶出量显著大于传统饮片(P<0.01),约是传统饮片的1.5-2倍；且有效成分溶出量随溶剂量的增多而增多。20倍溶剂量条件下,有效成分溶出最多。3.1.5小柴胡汤超微饮片与传统饮片总黄酮、黄芩苷溶出速度比较实验结果表明,在相同溶剂量条件下,浸泡(或煎煮)不同时间,超微饮片中总黄酮、黄芩苷的溶出量显著多于传统饮片,两者比较有统计学意义(P<0.05)；超微饮片组内比较,浸泡不同时间总黄酮、黄芩苷溶出量无显著性差异(P>0.7),提示超微饮片有效成分在短时间内可快速溶出。传统饮片总黄酮、黄芩苷溶出量与煎煮时间呈正相关,在60min时溶出最多。实验结果提示,药材经超微粉碎后细胞破壁,细胞内有效成分溶出速率显著加快。3.1.6葛根芩连汤超微饮片与传统饮片中黄连总生物碱、葛根素溶出量比较实验结果表明,在相同条件下,葛根芩连汤超微饮片中黄连总生物碱的溶出量是传统饮片的1.74倍；葛根素溶出量是传统饮片的1.37倍。实验结果表明,中药材经超微粉碎后,有效成分溶出量增加。3.2超微饮片与传统饮片药效学剂量相关性3.2.1小柴胡汤超微饮片与传统饮片药效学剂量相关性研究在小鼠免疫性肝损伤实验模型上,模型组ALT、AST活性显著升高,统计学结果表明与空白对照组比较有显著性差异(P<0.05)。联苯双酯组,超微饮片与传统饮片1、2组均可显著降低免疫性肝损伤小鼠血清ALT活性(P<0.05)；超微饮片1、2组与传统饮片1组均可降低血清AST活性,与模型对照组相比有统计学意义(P<0.05)；联苯双酯组对降低血清AST活性不显著。对实验数据进行分析可知,在降低血清转氨酶活性方面,超微饮片最低有效剂量是传统饮片的1／4倍。联苯双酯组、超微饮片1组与传统饮片1组均可减轻肝脏病理损伤程度,与模型对照组相比有显著性差异(P<0.05),提示小柴胡汤对肝脏损伤具有保护作用。在改善肝脏病理方面,超微饮片最低有效剂量是传统饮片的1／2倍。与空白对照组比较,模型对照组脾脏指数有统计学差异(P＜0.05),表明免疫性肝损伤小鼠脾脏增大、肿胀明显；肝脏及胸腺指数没有显著改变。实验结果表明,各给药组对肝、脾、胸腺脏器指数影响不显著。在脾淋巴细胞增殖实验中,超微饮片与传统饮片1、2组均可抑制脾淋巴细胞增殖,与模型对照组相比有显著性差异(P＜0.05)。联苯双酯组对淋巴细胞增殖影响不显著。对超微饮片与传统饮片剂量进行分析可知,在抑制淋巴细胞增殖方面,超微饮片最低有效剂量是传统饮片的1／2倍。3.2.2葛根芩连汤超微饮片与传统饮片药效学剂量对比研究在小肠炭末推进实验中,与空白对照组相比较,黄连素组、超微饮片1-4组及传统饮片1组均能降低正常小鼠小肠炭末推进率,统计学结果表明有显著性差异(P<0.05),提示药物通过抑制小肠的蠕动起到止泻作用；小肠炭末推进实验数据表明,超微饮片最低有效剂量是传统饮片的1／16倍。在体外抑菌实验中,阿莫西林组、超微饮片1组与传统饮片1组均能抑制金黄色葡萄球菌、福氏痢疾杆菌及志贺痢疾杆菌的生长,与空白对照组比较有统计学意义(P<0.05)。对实验数据分析可知,在相同剂量下,超微饮片抑菌作用优于传统饮片；体外抑菌实验数据表明,超微饮片最低有效抑菌剂量是传统饮片的1／2倍。4、研究结论4.1因中药材质地各异,经超微粉碎后,细胞破壁率一般可达90%以上。显微镜下可见绝大部分为颗粒状物质,平均粒径在2-30gm,个别大的团块直径达100μm。除极个别石细胞、木纤维等可见完整细胞外,其余均无完整细胞形态。4.2中药超微饮片保持了中药材固有的药效学物质基础。中药材经超微粉碎细胞破壁后,粒径虽然达到微米级,但其细化程度尚不涉及原子或分子结构层面的变化,因此保持了中药材固有的药效学物质基础。薄层色谱鉴别实验结果可见,超微饮片与传统饮片均显示出相同位置、相同性质的斑点,提示两种饮片中化学成分一致,超微粉碎不会改变药材的药效学物质基础。4.3中药超微饮片有效成分溶出量显著增加,溶出速率显著加快。中草药的主要有效成分通常分布于细胞内与细胞间质,且以细胞内为主。与传统饮片相比,中药超微饮片细胞破壁后,细胞内有效成分不经过细胞膜阻挡而直接溶出,有效化学成分溶出量约为传统饮片的2倍。中药超微饮片不需煎煮,开水浸泡10min有效成分即可大量溶出。4.4药效学研究结果提示,中药超微饮片应用于临床,可以显著减少药材使用量,但不同方剂、不同观察指标的选择可能影响两种饮片的量效关系。在小柴胡汤对小鼠免疫性肝损伤实验中,超微饮片是传统饮片的1／4剂量即可显著降低ALT活性水平,而超微饮片是传统饮片的1／2剂量时才能改善AST活性水平及肝脏病理损伤；在葛根芩连汤对小鼠小肠炭末推进的实验中,超微饮片是传统饮片的1／16剂量可显著抑制小肠蠕动,而体外抑菌实验结果表明,超微饮片是传统饮片的1／2剂量时两者抑菌作用相当。