曾经“消瘦”的中国人正面临着体重迅速增长的巨大问题。近十年来,随着肥胖患病率的不断增长,以及2型糖尿病、血脂异常、胰岛素抵抗及其相关代谢综合征的相继增长,中国已经处于疾患脂肪性肝病(Fitty Liver disease, FLD)的危险之中。脂肪肝(Fatty Liver)是一种病变主体在肝小叶,以肝细胞弥漫性脂肪变为主的临床病理综合征。通常所述脂肪肝主要指慢性脂肪肝,病理上分为单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎和脂肪性肝肝硬化。尽管嗜酒、营养过度摄入是脂肪肝的重要病因,但当前脂肪肝发病率的迅猛增长主要与肥胖及其相关代谢综合征的高发密切相关。因此,脂肪肝本质是机体能量过剩或脂质异位蓄积于肝所致,主要表现为肝脏实质细胞脂肪变性。如果形象理解,肝脏就是能量的“化工厂”,当输入的能量物质过多,超过了代谢能力;或机体代谢缓慢,能量积蓄未能消耗时,肝脏能量生产能力和输出能力失衡,即发生了脂肪肝。在治疗方法上,治疗营养过剩型脂肪肝的最有效策略是限制饮食(减少生产)和运动锻炼(促进输出)。另外药物治疗试图通过药物来激活肝脏细胞能量代谢车间的运作效率。研究发现,肝脏脂质代谢是一个复杂的网络调节系统,包括多种血载脂蛋白(乳糜颗粒、LDL、HDL),细胞因子(脂联素、瘦素),细胞内酶系统(AMPK、ACC、FAS、CPT-1 )、受体(CD36、FAT)、核受体(PPAR、PXR、LXR、SREBP)。值得庆幸的是,一些重要的转录和代谢调节因子是整个网络调节的关键节点。如:PPAR-α、SREBP-1c、AMPK。调控这些关键靶点将帮助肝脏朝着加速分解代谢的方向运作,从而治疗脂肪肝。我们关注腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)靶点,认为AMPK处在调控脂质代谢网络的上游。当感受到细胞能量物质AMP/ATP变化时,AMPK的磷酸化增强,引起脂代谢调节因素的级联反应。激活肝细胞AMPK通路既可以加速脂肪酸的分解代谢,又抑制脂质的合成代谢。我们最近发现,中药的黄连和三七在体内和体外改善了脂肪肝,可能的机制是通过激活AMPK信号途径。让人振奋的是,黄连和三七的联用发挥了协同效应,治疗脂肪肝的效果显著。这样的发现促使我们对中药黄连联用三七治疗脂肪肝的药物开发充满好奇。田黄片是黄连生物碱组分配伍三七总皂苷组分的调脂候选新药。是导师郭姣教授在多年临床实践和渊博的中医理论基础上,首次提出“调肝启枢化浊通络”理论,并在该理论指导下,通过脂代谢关键靶点的分子模型高通量筛选技术和高脂血症大鼠模型筛选调血脂有效成分群;利用正交均匀设计等现代实验设计方法对调血脂有效成分群进行配伍设计。从“复方贞术调脂方”中筛选出由有效部位配伍、调脂功效更显著、安全的调脂候选新药——田黄片。但是田黄片的有效成分(群)调脂的效应到作用机制,还存在一些问题需要解决:①黄连的降脂药效物质基础还不清楚,除了小檗碱,是否还有其他生物碱成分具有降脂活性?②黄连降脂活性成分的体外活性是否在体内动物模型中可以对接?③黄连碱是否与小檗碱报道的一样,通过激活肝细胞内AMPK信号途径改善脂质蓄积?④三七的降脂药效物质基础还不清楚,哪些皂苷类成分降脂活性较好?⑤小檗碱联合皂苷类成分为何在体内降脂效果显著,优于单用效果,是否产生了化学协同效果?⑥小檗碱与人参皂苷的联合是否共同激活了 AMPK靶点,发挥药理协同作用?为了回答这些问题,深度研究田黄片的有效成分(群)。本课题运用实验室自建的肝细胞萃取-HPLC分析联合HepG2脂肪变性细胞分析筛选黄连,三七中降脂活性成分。以HepG2细胞株为研究对象,以AMPK靶点为研究靶标,探究黄连中黄连碱,小檗碱联用人参皂苷Rb1的降脂的分子机制。采用SD大鼠动物模型为研究对象,观察黄连碱,小檗碱和人参皂苷Rb1,以及小檗碱联用人参皂苷Rb1的治疗脂肪肝的效应。运用药物代谢动力学,寻找小檗碱提高人参皂苷Rb1生物利用度的科学证据。实验方法:1.建立一种中药降脂活性成分的体外筛选方法。该方法基于肝细胞萃取-HPLC分析联合脂肪酸诱导的HepG2肝细胞脂肪变性分析。首次应用于黄连总生物碱(CAE)中降脂活性成分,三七总皂苷(PNS)中降脂活性成分的筛选,进而筛选活性单体的降脂活性。2.以HepG2细胞株为研究工具,基于体外筛选结果,选取黄连碱、小檗碱、人参皂苷Rb1、小檗碱联合人参皂苷Rb1为研究对象。在此基础上,针对细胞AMPK信号通路,采用Western B1ot法观察黄连碱,小檗碱联用三七皂苷Rb1激活AMPK磷酸化的效应关系,观察剂量效应关系;观察单用与联用的效应关系;3.以HepG2细胞株为研究工具,考察AMPK信号通路下游调脂基因的变化,采用RT-PCR法观察黄连碱,小檗碱联用三七皂苷Rb1对脂肪酸β氧化的限速酶CPT-1和胆固醇合成限速酶HMG-CoA的基因表达影响。4.建立一种HPLC法测定肝细胞内ATP、ADP和AMP含量的方法,以HepG2细胞株为研究工具,观察黄连碱,小檗碱联用三七皂苷Rb1对细胞内能量物质的影响。细胞内AMP的上调是AMPK激活的直接原因,该方法的建立和应用为调脂活性单体是否调控AMPK靶点提供佐证。5.采用液质联用(LC-MS)技术研究小檗碱联用三七皂苷Rb1和单用的药代动力学,SD大鼠灌胃给药,多点血药浓度监测,绘制药时曲线,进行单用和联用分组实验,寻找小檗碱和人参皂苷Rb1相互促进生物利用度的科学证据。6.采用高脂饲料诱导SD大鼠建立脂肪肝动物模型,治疗性灌胃给药,造模6周,给药5周,观察高剂量组(50 mg/kg.d)黄连碱、低剂量组(10 mg/kg.d)黄连碱体内治疗脂肪肝的效果。以及小檗碱组(50 mg/kg.d)、三七皂苷Rb1组(100 mg/kg.d)、小檗碱联用三七皂苷Rb1组体内治疗脂肪肝的效果。测定一系列血指标测定(TG、TC、Glu、HDL、LDL、AST、ALT),肝脏甘油三酯指标(TG),肝组织病理切片分析(HE染色),评价调脂活性成分的治疗效果。7.采用SPSS17.0统计软件处理,以均数±标准差(x±SD)表示,方差齐时,多样本均数比较均采用单因素方差分析,两两比较采用LSD法;方差不齐时,两两比较采用Dunnett’ sT3方法,P<0.05表示有统计学差异。实验结果:1.运用自建中药降脂活性成分的体外筛选方法,鉴定出黄连总生物碱中的小檗碱和黄连碱为肝细胞亲和成分,其他生物碱为弱亲和成分。在肝细胞脂肪变性模型上,测定细胞内甘油三酯含量,与模型组比较,小檗碱0.2 μg/mL、1.0μg/mL、5.0μg/mL、25.0μg/mL细胞内甘油三酯含量降低,差别有统计学意义(F=3163.505,P<0.001),细胞内脂质抑制率分别为 17.2%、34.1%、51.3%、59.4%,呈浓度效应依赖关系;与模型组比较,黄连碱0.2μg/mL、1.0μg/mL、5.0 μg/mL、25.0μg/mL细胞内甘油三酯含量降低,差别有统计学意义(F=321.108,P<0.001),细胞内脂质抑制率分别为50.4%、49.9%、47.2%、52.7%,不呈浓度效应依赖关系。鉴定出三七总皂苷中的人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1为肝细胞亲和成分,其他皂苷为弱亲和成分。在肝细胞脂肪变性模型上,人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1均为强降脂活性成分,测定细胞内甘油三酯含量,与模型组比较,人参皂苷 Rb1 浓度为 5.0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL 细胞内甘油三酯含量降低,差别有统计学意义(F=2619.654,P<0.001),细胞内脂质抑制率分别为14.7%、25.2%、36.5%、47.3%,呈浓度效应依赖关系;与模型组比较,人参皂苷 Rg1 浓度为 5.Oμg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100 μg/mL 细胞内甘油三酯含量降低,差别有统计学意义(F=161.136, P<0.001),细胞内脂质抑制率分别为10.4%、17.2%、27.2%、32.4%,呈浓度效应依赖关系。与模型组比较,人参皂苷Rg1组50 μg/mL、小檗碱组5.0 μg/mL、小檗碱(5.0 μg/mL)联合人参皂苷Rb1 (50 μg/mL)组细胞内甘油三酯含量降低,差别有统计学意义(F=255.672, P<0.001),细胞内脂质抑制率分别为 13.0%、30.2%、27.2%、48.5%,。上述结果说明小檗碱、黄连碱和人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1均为强降脂活性成分,小檗碱联合人参皂苷Rb1降脂效果优于单用。2.在HepG2细胞中观察黄连碱、小檗碱和人参皂苷Rb1均不同程度诱导AMPK的磷酸化,Western Blot结果显示,较正常细胞组,小檗碱组(25.0μg/mL),人参皂苷Rb1组(100μg/mL),小檗碱(5.0μg/mL)联合人参皂苷Rb1 (50 μg/mL)组均促进AMPK的磷酸化(P<0.05),差别有统计学意义(F=141.048, P<0.001);Western Blot结果显示,各组不同程度诱导ACC的磷酸化,较正常细胞组,小檗碱组(25.0μg/mL),小檗碱(5.0μg/mL)联合人参皂苷Rb1 (50μ/mL)组均促进ACC的磷酸化(P<0.05),差别有统计学意义(F=173.987, P<0.001)。上述结果说明小檗碱和人参皂苷Rb1均为不同程度诱导AMPK磷酸化,小檗碱联合人参皂苷Rb1诱导效果优于单用。3. RT-PCR技术观察降脂的活性单体对AMPK信号通路下游蛋白和酶的基因水平的影响。较正常细胞组,黄连碱高浓度组(25.0 μg/mL),小檗碱组(25.0μg/mL),人参皂苷Rb1组(100μg/mL),小檗碱(5.0μg/mL)联合人参皂苷Rb1(50 μg/mL)组均上调了 CPT-1 mRNA的表达(P<0.05),差别有统计学意义(F=286.281,P<0.001),均下调了HMG-CoAmRNA 的表达(P<0.05),差别有统计学意义(F=33.582,P<0.001)。结果说明两个靶基因上小檗碱联用人参皂苷Rb1组的诱导效应是优于其他药物组。4.黄连碱和小檗碱改变了 HepG2细胞内的能量物质ATP,ADP, AMP的比例关系,计算能荷(EC)的结果表明,与正常细胞组比,黄连碱高浓度组(25.0 μg/mL),小檗碱组(25.0μg/mL),小檗碱(5.0 μg/mL)联合人参皂苷Rb1 (50 μg/mL)组均降低了细胞EC值(P<0.05),差别有统计学意义(F=286.281,P<0.001),而人参皂苷Rb1(100 μg/mL)浓度对细胞EC较正常组无统计学差异。结果说明小檗碱、黄连碱和均能影响细胞内能量物质ATP,ADP,AMP的含量,降低细胞EC值,从而激活AMPK信号通路。5.高脂SD大鼠造模后,给药30天。①与正常对照组比较:模型组升高肝指数(P<0.05)、提高了血TG水平(P<0.05)、血Glu增高(P<0.05),肝组织TG水平提高(P<0.05),血AST升高(P<0.05),病理组织学呈中～重度脂肪变。这说明模型组动物呈高甘油三酯血症,高血糖特征,肝功能受损特征,各项指标符合脂肪肝表现,造模效果理想。②各药物组与模型组进行多重比较,肝指数(F=31.203, P<0.001)、血清 TG 水平(F=15.190, P<0.001)、血清 CHO水平(F=18.308,P<0.001)、血清 LDL 水平(F=13.557,P<0.001)、血清 HLD 水平(F=14.226,P<0.001)血清 Glu 水平(F=25.807,P<0.001),肝组织 TG 水平(F=55.946, P<0.001)、血 ALT 水平(F=8.409, P<0.001)、血 AST 水平(F=7.473,P<0.001),差异有统计学意义。③与模型组比较,黄连碱高、低剂量组的肝指数,血清TG、Glu水平,肝组织TG,血肝功能ALT指标水平均有不同程度缓解(P均<0.05),各项指标黄连碱高剂量组疗效优于低剂量组,但是黄连碱高、低剂量组对血CHO、血LDL、血HDL无降低作用,反而呈升高特征。结果说明黄连碱具有治疗脂肪肝的功效,高剂量组效应好于低剂量组,能够降低血甘油三酯、血糖、改善肝功能,但不能降低血总胆固醇脂。④与模型组比较:小檗碱联用人参皂苷Rb1组肝湿重和肝指数改善最佳,血清TG、Glu水平、肝组织TG均显著降低(P均<0.05),肝组织脂肪空泡减少,各项指标参数优于小檗碱单用和人参皂苷Rb1单用;⑤与模型组比较,小檗碱的降糖和降脂效果优于人参皂苷Rb1单用组,但是人参皂苷Rb1组改善肝功能效果优于小檗碱组。6.小檗碱联用人参皂苷Rb1的药时曲线结果显示,联用后人参皂苷Rb1的药物代谢参数显著改善,Tmax提前(T=7.000, P=0.020),差别有统计学意义,Cmax较单用人参皂苷Rb1高2.5倍效应关系(T=-43.259, P=0.001),AUC(0-t)显著增大(T=-5.739, P=0.029),差别有统计学意义;比较小檗碱单用和联合的药时曲线,Tmax未有统计学差异,联用组Cmax小于单用组(T=6.643,P=0.022)。结果说明,小檗碱联用人参皂苷Rb1能够显著改善人参皂苷Rb1的药物吸收特征,增加了人参皂苷Rb1的生物利用度,但联用后小檗碱的药物代谢表现未有改善。结论:建立了肝细胞萃取-HPLC分析联合脂肪酸诱导HepG2肝细胞脂肪变性模型分析筛选中药调脂活性成分的方法,筛选出黄连总生物碱中的小檗碱、黄连碱以及三七总皂苷中人参皂苷Rb1为代表的调脂活性单体。在体外模型中,调脂活性单体可以改善肝脂肪变性肝细胞的脂质蓄积,他们调脂的共同作用靶点可能是激活AMPK信号通路。这种激活AMPK与影响肝细胞的能量物质AMP、ADP、ATP的量有着密切的关系。高脂饲料诱导的大鼠脂肪肝模型验证黄连碱、小檗碱、人参皂苷Rb1均具有治疗脂肪肝的效应,其中黄连碱高剂量组治疗效果优于黄连碱低剂量组。小檗碱联合人参皂苷Rb1的治疗脂肪肝的效果优于单用小檗碱或单用人参皂苷Rb1,这种增强协同效应可能与小檗碱促进人参皂苷Rb1生物利用度有关。本课题研究对象是中药黄连、三七的调脂活性单体,以调脂活性成分体外筛选方法为切入点,以AMPK信号通路为主轴,在体内、体外模型上进行黄连碱、人参皂苷Rb1联用小檗碱降脂活性的效应研究;在基因和蛋白层面上探究降脂的分子机制;从药物代谢动力学角度分析活性单体联用的协同效应,为中药活性成分治疗脂肪肝疾病提供可靠和深入的科学证据。