【摘 要】
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目的:空气污染是重要的、全球性的公共威胁。细颗粒物(fine particulate matter,PM2.5)作为首要污染物的大气环境问题十分严峻,严重危害人类健康,其中最为直接的是呼吸系统损伤。上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）不仅参与器官纤维化,还与肿瘤的侵袭转移相关。自噬是通过将受损细胞器和蛋白降解,用以维持细胞内平衡的方式,对疾病有
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目的:空气污染是重要的、全球性的公共威胁。细颗粒物(fine particulate matter,PM2.5)作为首要污染物的大气环境问题十分严峻,严重危害人类健康,其中最为直接的是呼吸系统损伤。上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）不仅参与器官纤维化,还与肿瘤的侵袭转移相关。自噬是通过将受损细胞器和蛋白降解,用以维持细胞内平衡的方式,对疾病有重要的调节作用。本课题通过PM2.5体外染毒支气管上皮细胞（16HBE）的方式,探讨PM2.5诱导16HBE细胞上皮间质转化的机制,以及自噬与Nod样受体蛋白3（Nod-like receptor protein 3,NLRP3）在对EMT的调控作用和机制,以进一步了解PM2.5的致病机理并提供毒理学依据,为大气环境疾病提出理论依据,以探索预防PM2.5相关疾病的方法和治疗方向。方法:（1）PM2.5样本来自四川省绵阳市;使用X射线衍射光谱仪检测样本的主要矿物颗粒;激光粒度分析仪检测样本粒径大小的分布情况。（2）用不同浓度的PM2.5浓度体外染毒16HBE细胞,12h、24h、48h后,使用CCK-8试剂检测细胞存活率,评估PM2.5对16HBE细胞的毒性作用。（3）PM2.5染毒16HBE细胞24h后,倒置显微镜直接镜检和瑞氏-吉姆萨复合染色的方式观察细胞形态变化;荧光色素单丹磺酰尸胺（MDC）法染色检测自噬活性;Western blot法检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、NLRP3、caspase-1、α-SMA、E-cadherin蛋白表达;DCFH-DA染色后,荧光显微镜观察ROS情况,并用流式细胞术检测16HBE细胞的ROS荧光水平。（4）200μg/m L PM2.5联合自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）处理16HBE细胞后,Western blot法检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、NLRP3、caspase-1、α-SMA、E-cadherin蛋白表达,DCFH-DA染色结合流式细胞术检测分析胞内ROS的荧光强度,探讨3-MA对NLRP3炎性小体、EMT、ROS的影响。（5）200μg/m L PM2.5联合NLRP3抑制剂MCC950处理16HBE细胞后,使用Western blot法检测NLRP3、caspase-1、α-SMA、E-cadherin蛋白表达,DCFH-DA染色结合流式细胞术检测ROS水平情况,探讨MCC950对PM2.5诱导16HBE细胞EMT和ROS的影响。结果:（1）PM2.5样本主要的矿物颗粒为石英;样本中95%的颗粒粒径小于等于2.00μm。（2）PM2.5染毒可降低16HBE细胞存活率,随着PM2.5浓度和染毒时间的增加,细胞存活率亦逐渐降低,呈一定的剂量和时间依赖性。（3）PM2.5染毒16HBE之后,部分细胞失去原有形态逐渐伸长呈梭形,细胞间隙增宽,排列紊乱,出现间质细胞特性;经MDC染色并用荧光显微镜观察发现细胞荧光强度增强,自噬活性增强,同时自噬蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、NLRP3、caspase-1、α-SMA蛋白表达增加,E-cadherin降低,ROS水平增加。（4）200μg/m L PM2.5联合自噬抑制剂3-MA处理16HBE细胞后,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、NLRP3、caspase-1、α-SMA蛋白表达降低,E-cadherin升高,并使ROS水平的下降。（5）MCC950可下调LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、NLRP3、caspase-1、α-SMA,上调E-cadherin蛋白表达,并伴随着胞内ROS水平的降低。结论:（1）短期的PM2.5暴露可促进16HBE细胞自噬的发生、NLRP3炎性小体的活化,并诱导EMT形态的改变和相关蛋白的表达。（2）自噬抑制剂3-MA在抑制自噬的同时,可以抑制NLRP3炎性小体和PM2.5诱导16HBE发生的EMT,并降低胞内ROS的荧光强度。（3）NLRP3炎性小体抑制剂MCC950可抑制EMT,并伴随着ROS的降低。
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