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该实验中,以trail分子作为治疗分子,以感染效率较高的腺病毒作为载体,对HepG2、Hep3B、Hela和A549等肿瘤细胞和chang liver正常细胞作了诱导凋亡的体外实验研究.虽然trail分子能够选择性地诱导恶性转化的肿瘤细胞发生凋亡,但是腺病毒的包装细胞,293细胞也是一种经转化的永生型细胞,也有可能在包装过程中被trail分子诱导发生凋亡.为避免包装的中断,我们同时应用了"GAL4/VP16融合转录因子、G5E1b-TATA启动子"系统对trail基因的表达进行调控,使其在包装阶段低表达,在感染杀伤阶段高表达.该实验包括以下三部分内容:第一部分 trail基因的克隆、表达载体的构建及对肿瘤细胞体外杀伤效应研究 利用RT-PCR方法从胎儿脾脏组织中扩增出人trail基因的全长cDNA,构建表达载体pcDNA3-trail,先应用脂质体介导的方法转染HepG2、Hep3B、Hela和A549等肿瘤细胞,同时以pcDNA<,3>转染同种细胞作为阴性对照.通过MTT法检测肿瘤细胞相对存活率,初步观察trail分子对肿瘤细胞的杀伤作用.第二部分 GAL4/VP16融合转录因子活性的研究 构建含有融合转录因子GAL4/VP16的表达载体pcDNA<,3>-GV和含有受G5E1b-TATA启动子驱动的报告基因EGFP的表达载体pGL<,3>-G5E1b-TATA-EGFP,应用脂质体介导的方法将这两种表达载体共转染HepG2、Hep3B、Hela和A549等肿瘤细胞和293细胞,同时以pGL<,3>-G5E1b-TATA-EGFP单独转染上述细胞作为阴性对照,而以pcDNA3-EGFP单独转染同种细胞作为阳性对照.第三部分 双腺病毒系统的构建及对肿瘤细胞和正常细胞体外杀伤效应研究 构建了Adpshuttle-G5E1b-TATA-trail-BGHpA和Adpshuttle-cmv-GV两种腺病毒载体.以相同的感染复数共同感染HepG2、Hep3B、Hela和A549等肿瘤细胞和chang liver正常细胞.通过RT-PCR,Western blot验证trail基因在GAL4/VP16融合转录因子调控下,在各种细胞系中有高表达后,再通过形态学和生物化学等方法验证trail分子作为一种凋亡分子可以选择性诱导肿瘤细胞HepG2、Hep3B、Hela和A549发生凋亡,而对正常细胞chang liver基本无影响.