研究目的:自噬是一个在生物进化上相对保守的过程,涉及长寿蛋白的降解;它在细胞的生长、发育、稳态平衡中发挥了重要的作用。氧化应激可以诱导自噬活动的发生,从而促进细胞内受损及有害物质的降解。在我们的研究中,主要探讨氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)自噬中的作用及其对Akt/m TOR/p70S6K信号通路的影响。研究方法:传代培养HUVECs,选用透气的细胞培养瓶、DMEM培养基(含10%胎牛血清+100U/ml青霉素和100U/ml链霉素),细胞呈现出贴壁生长状态,放置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养,24小时后换液继续培养,并注意观察细胞生长情况,约两天传一代,选用第四代HUVECs,以10*10^4/ml的细胞密度接种于六孔板中,每个孔内接种2ml,然后取对数生长期的细胞,将培养的HUVECs分为ox-LDL组和对照组,分别加入100ug/ml ox-LDL和等体积的磷酸盐缓冲液(PBS),培养6h、12h后,收集细胞,应用透射电子显微镜观察自噬体,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)方法检测LC3、p62 m RNA表达水平;蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot方法检测LC3、p62、P-Akt/Akt、P-m TOR/m TOR、P-p70S6K/p70S6K蛋白表达水平。研究结果:1.经ox-LDL(100ug/ml)处理HUVECs 6小时和12小时,后用透射电子显微镜观察细胞的超微结构变化。透射电镜显示,对照组细胞核膜完整,染色质结构正常,胞浆内各细胞器、细胞核形态和分布基本正常,未见明显自噬空泡,溶酶体数目未见明显增多。Ox-LDL(100ug/ml)作用于HUVECs 6h、12h后,细胞质中可见包含部分细胞质内成分、双层膜结构的自噬体,表明ox-LDL可诱导HUVECs发生自噬。自噬体可能源自无核糖体内质网分离的膜,这些分离的膜伸长,在两端弯曲以形成C形结构和双膜液泡,当自噬体与溶酶体融合时,内膜消失,自噬体变成单膜自噬泡。并且,6h处理组中的自噬体数量高于12h处理组。2.LC3-Ⅱ的检测作为自噬激活的标志物,与对照组相比,处理组细胞显示LC3-Ⅱ的m RNA和蛋白表达水平增加,P<0.05为差异有统计学意义。此外,我们发现处理组细胞中p62的m RNA和蛋白表达水平降低,P<0.05为差异有统计学意义。表明,p62与自噬效应蛋白LC3存在相互作用,并通过自噬溶酶体途径降解。3.Ox-LDL处理组细胞中的P-Akt/Akt、P-m TOR/m TOR、P-p70S6K/p70S6K的蛋白表达水平低于对照组,P<0.01为差异有统计学意义,主要表现为ox-LDL抑制了Akt/m TOR/p70S6K信号传导通路中磷酸化蛋白P-Akt、P-m TOR、P-p70S6K的表达水平;然而,对信号传导通路中总蛋白Akt、m TOR、p70S6K的表达水平影响不大。研究结论:在本研究中,我们提供证据表明ox-LDL(100ug/ml)可以诱导HUVECs发生自噬。并且,我们的研究证明在ox-LDL处理HUVECs 6小时和12小时后自噬体的数量显著增加;与对照组相比,LC3-Ⅱ的m RNA和蛋白表达水平上调,而ox-LDL处理组中p62的水平下调;这种效应与12小时处理组相比,6小时处理组中的作用更为显着。并且,Akt/m TOR/p70S6K信号传导通路中P-Akt、P-m TOR、P-p70S6K的表达水平降低。基于此,我们认为ox-LDL(100ug/ml)通过抑制Akt/m TOR/p70S6K信号传导通路诱导HUVECs自噬。