脂肪细胞在腹膜血管新生和内皮功能紊乱中的作用研究

来源 :上海交通大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zhoupeng4348
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背景:长期腹膜透析(腹透)患者有发生腹膜超滤衰竭导致患者退出腹透和发生心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)导致患者死亡的风险。内皮细胞与腹膜血管新生从而导致腹膜超滤衰竭及CVD的发生密切相关。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是调节内皮细胞功能、介导血管新生的重要细胞因子。内皮细胞功能紊乱后细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)、内皮素-1(endothelin-1,ET-1)等表达增加,参与CVD的发生与发展。既往研究显示长期腹透患者出现内脏脂肪含量增加,内脏脂肪可以分泌多种细胞因子。然而腹透患者内脏脂肪增加和腹膜血管新生及CVD发生之间的关系目前仍不清楚。目的:探讨在腹膜透析中脂肪细胞对血管新生及内皮细胞功能紊乱的影响。方法:一、体外实验:诱导小鼠前脂肪细胞3T3-L1分化成为脂肪细胞。脂肪细胞分为3组,分别为:1.对照组;2.高糖组:培养基所含葡萄糖浓度为139mmol/l;3.高渗组:培养基渗透压与高糖组相同。24h后酶联免疫吸附试验(enzyme linked immune sorbent assay,ELISA)检测脂肪细胞上清中VEGF表达量。体外培养小鼠微血管内皮细胞,细胞分为6组,分别为:1.对照组;2.高糖组:培养基所含葡萄糖浓度为139mmol/l;3.高渗组:培养基渗透压与高糖组相同;4.对照脂肪细胞组:使用脂肪细胞对照组上清干预内皮细胞;5.高糖脂肪细胞组:使用脂肪细胞高糖组上清干预内皮细胞;6.高渗脂肪细胞组:使用脂肪细胞高渗组上清干预内皮细胞。12h后观察内皮细胞在Matrigel胶上的管状结构形成能力、在Transwell板上迁移能力的改变,以及脂肪细胞上清内加入VEGF中和抗体对内皮细胞管状结构形成和迁移能力的影响。24h后用Western blot法检测各组内皮细胞ICAM-1、ET-1表达量的变化,并利用p38丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)抑制剂SB203580检测p38 MAPK信号通路和ICAM-1、ET-1表达的关系。二、体内实验:构建前脂肪因子-1(Preadipocyte factor-1,Pref-1)过表达腺相关病毒(adeno associated virus,AAV)载体,将4周龄雄性C57BL/6小鼠分为4组,即:1.生理盐水组:2周龄小鼠腹腔注射100μl磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS),并于4周龄开始每天腹腔注射1.5ml生理盐水;2.腹透组:2周龄小鼠腹腔注射100μl PBS,并于4周龄开始每天腹腔注射1.5ml 4.25%腹透液;3.腹透+对照病毒组:2周龄小鼠腹腔注射100μl1×1012PFU/ml对照病毒,并于4周龄开始每天腹腔注射1.5ml 4.25%腹透液;4.腹透+目的病毒组:2周龄小鼠腹腔注射100μl 1×1012PFU/ml目的病毒,并于4周龄开始每天腹腔注射1.5ml 4.25%腹透液。注射周期30天。记录并观察小鼠体重及内脏脂肪量的改变。CD31免疫组化染色检测腹膜血管数量。伊文思蓝检测小鼠腹膜血管通透性。ELISA法检测小鼠血清VEGF和ICAM-1表达量。结果:体外实验中,前脂肪细胞3T3-L1成功诱导分化为脂肪细胞,成脂率>90%。与对照组(1572.50±83.89pg/ml)和高渗组(1803.21±25.94pg/ml)相比,高浓度葡萄糖显著上调脂肪细胞VEGF的表达(2088.36±107.18pg/ml)(P<0.05)。与对照组(12.3±0.6个/HP)相比,高浓度葡萄糖对微血管内皮细胞管状结构形成具有抑制作用(6.3±1.2个/HP)(P<0.01),但脂肪细胞经高浓度葡萄糖干预后的条件培养基可显著增加内皮细胞管状结构形成的数量(11.3±1.5个/HP)(P<0.01),高渗透压在其中并未发挥主要作用(8.7±0.6个/HP)(P<0.05)。VEGF中和抗体预处理可显著降低脂肪细胞高糖条件培养基的促内皮细胞管状结构形成作用(6.3±2.1个/HP)(P<0.05)。与对照组(2.3±1.2个/HP)相比,高浓度葡萄糖可以增加内皮细胞在Transwell板上的迁移(6.8±1.7个/HP)(P<0.05);而和高糖组相比,高浓度葡萄糖干预后的脂肪细胞条件培养基更显著得增加了内皮细胞的迁移(36.8±2.1个/HP)(P<0.05),同样,高浓度葡萄糖而非高渗透压的条件培养基是内皮细胞迁移增加的主要原因(31.5±2.6个/HP)(P<0.05)。VEGF中和抗体预处理也可显著降低脂肪细胞高糖条件培养基中的内皮细胞迁移数量(23.0±3.2个/HP)(P<0.05)。与高糖组(1.30±0.10)和对照脂肪细胞组(1.13±0.15)相比,高糖脂肪细胞组的内皮细胞ICAM-1表达显著增加(1.53±0.06)(P<0.05),其ICAM-1表达上调可以被p38 MAPK信号通路阻断剂抑制(0.93±0.12比1.19±0.03)(P<0.05)。而与高糖组(1.49±0.14)和对照脂肪细胞组(1.45±0.25)相比,高糖脂肪细胞组的内皮细胞ET-1表达也显著上调(2.24±0.27)(P<0.05),但并非由p38 MAPK信号通路介导(P>0.05)。体内实验中,与生理盐水组(0.23±0.08g)相比,腹透治疗可显著增加小鼠内脏脂肪含量(0.69±0.03g)(P<0.05),而外源性pref-1基因的表达可以抑制腹透小鼠内脏脂肪的生成(0.13±0.03g)(P<0.05)。同时,与生理盐水组(3.67±1.15个/HP)相比,腹透组小鼠肠系膜血管数目显著增加(11.00±2.00个/HP)(P<0.05),而抑制小鼠内脏脂肪生成则腹透小鼠肠系膜血管数显著较少(8.00±1.00个/HP)(P<0.05)。与生理盐水组(0.12±0.06)相比,腹透组小鼠腹膜血管通透性增加(0.29±0.03)(P<0.05),而抑制内脏脂肪生成后腹透小鼠腹膜血管的通透性显著降低(0.12±0.06)(P<0.05)。小鼠血清ELISA结果显示,腹透治疗可上调小鼠血清VEGF(94.50±16.98pg/ml比46.13±2.98pg/ml)(P<0.05)和ICAM-1的表达(54.41±10.97pg/ml比20.26±2.81pg/ml)(P<0.05),而减少小鼠内脏脂肪生成可以下调腹透小鼠血清VEGF表达(62.36±11.57pg/ml)(P<0.05)。同样,抑制腹透小鼠脂肪生成后小鼠血清ICAM-1表达量也显著下调(38.84±8.06pg/ml比54.41±10.97pg/ml)(P<0.05)。结论:非生理性腹透液的高糖成分,可以通过脂肪细胞影响内皮细胞的功能,与腹膜血管新生和腹透患者CVD的发生有关,减少内脏脂肪生成可以作为维持腹膜结构和功能的完整性以及预防CVD发生,从而维持腹透长期性和有效性的手段。
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