目的:牙周炎是全球第六大流行疾病,是牙周致病菌作用于牙周支持组织,刺激宿主免疫系统,诱导免疫细胞浸润及免疫因子趋化,并造成牙周支持组织发生进行性破坏的一类疾病。随着牙周炎的病变的进展,牙周软组织及牙槽骨出现溶解、吸收、破坏,进而导致牙齿发生松动甚至脱落。除引发口腔局部的功能障碍外,牙周炎还被证实与部分系统性疾病,如心脑血管疾病、糖尿病、面部及头颈部肿瘤等密切相关。有鉴于此,探讨牙周病的发生发展过程,研究其防治措施,则是当下口腔医学工作者面临的重要课题。虽然牙周炎的始动因素为龈下菌斑生态系失调,但单纯的菌群紊乱不足以引发牙槽骨稳定性异常。最新研究表明,宿主针对牙周致病菌的适应性免疫应答是导致牙周支持组织破坏的最主要原因。作为适应性体液免疫主要执行者,B细胞大量的存在于炎症区域的牙周组织内。除分泌特异性抗体外,B细胞还被证实可分泌多种细胞因子。这些细胞因子即可调节免疫反应,也同时参与骨组织代谢。这种骨系统与免疫系统间的交互作用被称之为骨免疫。核因子κB受体活化因子配体(Receptor Activator for Nuclear Factor-κB Ligand,RANKL)是一种Ⅱ型跨膜蛋白,是TNF受体(tumor necrosis factor receptor,TNFR)的主要配体。RANKL可与破骨前体细胞膜表面的核因子κB受体活化因子(Receptor Activator for Nuclear Factor-κB,RANK)结合诱导破骨细胞分化。有鉴于此,RANKL被认为是骨稳态调节过程中不可或缺的重要因子。由于B细胞与RANKL关系密切,探索牙周炎不同时期二者的相关性,就成为了研究B细胞参与牙槽骨稳态调节的有效手段。本研究拟通过动物实验与细胞实验相结合的方式,采用多种实验技术分析并说明参与牙周骨免疫的B细胞功能性亚群,并同时研究其作用机制,以期进一步明确牙周炎的发病机制。同时,由于记忆B细胞长期存在于牙周组织中且数量较为稳定,本研究也同时为牙槽骨生理性稳定、病理及应力性改建以及种植体周围炎的研究提供了一定的思路。方法:本研究由以下三部分组成:1.记忆B细胞调节RANKL效应初探采用结扎法建立实验性牙周炎病理模型。提取模型动物与健康动物的淋巴细胞,并将其分为下列亚群:淋巴细胞亚群——B细胞(CD20~+)、T细胞(CD3~+)、双阴性淋巴细胞(CD3~-CD20~-),B细胞亚群——记忆B细胞(CD20~+CD27~+CD38~-)、抗体分泌细胞(CD20~+CD27~+CD38~+)、Naive B细胞(CD20~+CD27~-)。培养各组内不同细胞亚群48小时后采用流式细胞术、ELISA以及Real time PCR检测不同组别细胞RANKL蛋白及mRNA的表达情况。对比分析说明牙周炎对上述效应的影响。同时采用Real time PCR法分析不同亚群内ERK、p38以及JNK的表达情况,以期初步揭示牙周炎症影响淋巴细胞亚群表达RANKL的潜在机制。2.记忆B细胞调节破骨细胞分化的效应与机制研究提取大鼠股骨骨髓源性巨噬细胞作为破骨前体细胞备用。取实验1中不同细胞亚群的培养基置于96孔板内,以10~4/孔加入破骨前体细胞进行培养,每3天半量换液。对照组采用anti-RANKL进行拮抗。7天后收集细胞,TRAP染色评价各培养孔内生成的破骨样细胞数量,同时采用Real time PCR法分析各组内破骨细胞分化相关基因RANK、NFATc1、c-Src的表达情况。3.牙周炎宿主记忆B细胞骨免疫的效应及机制研究取牙周炎模型动物的记忆B细胞,经尾静脉回输到健康受体内建立过继转移模型。取等量健康及过继转移模型大鼠,分为健康对照组、牙周炎对照组、牙周炎-过继转移模型组、牙周炎-过继转移模型-拮抗组。除健康对照组外其余各组采用结扎法建立牙周炎模型,牙周炎-过继转移模型-拮抗组组在建模后给予anti-RANKL治疗。4周后处死实验动物,取其牙龈、患侧上颌骨(健康对照组取同侧)、龈沟液及外周血清。测量各组别实验动物釉牙骨质界-牙槽嵴顶的距离;TRAP染色分析各患牙冠下0.5mm内破骨细胞分布长度;Real time PCR法分析牙龈内RANKL mRNA的表达差异;ELISA检测龈沟液及外周血清中RANKL、IL-1β、IL-6、IL-17A以及TNF-α的浓度。结果:1.健康状态下,各淋巴细胞亚群均可表达RANKL,T、B细胞表达RANKL的水平显著高于双阴性淋巴细胞。牙周炎时,B细胞表达RANKL的水平显著上升,高于T细胞及双阴性淋巴细胞。在B细胞亚群中,健康时记忆B细胞及抗体分泌细胞表达RANKL水平高于Naive B细胞。牙周炎时,记忆B细胞表达RANKL水平显著上调,并高于其它B细胞亚群。上述效应同时体现在蛋白与基因层面上。各亚群中p38表达水平与RANKL呈正相关。2.所有淋巴细胞及B细胞不同亚群所分泌的可溶性RANKL均具有诱导破骨细胞分化的能力,anti-RANKL可有效拮抗这一效应。在健康状态下,T、B细胞诱导破骨细胞分化的能力高于双阴性淋巴细胞。牙周炎时,B细胞诱导破骨细胞分化的能力显著升高并超越T细胞及双阴性淋巴细胞。在B细胞亚群中,健康时记忆B细胞及抗体分泌细胞诱导破骨细胞分化的能力高于Naive B细胞。牙周炎时,记忆B细胞诱导破骨细胞分化的能力显著升高,高于抗体分泌细胞及Naive B细胞。3.与常规牙周炎病理模型相比,过继转移模型动物牙槽骨吸收更为显著,牙周破骨细胞更多。同时在其牙龈内可有更多的RANKL mRNA表达。此外,过继转移模型动物龈沟液中RANKL、IL-1β、IL-6、IL-17A水平均显著高于常规牙周炎病理模型动物。anti-RANKL可有效拮抗过继转移模型动物的牙槽骨吸收及牙周破骨细胞生成,并同时显著下调其龈沟液内RANKL的水平。结论:1.牙周炎症反应可上调记忆B细胞的RANKL表达水平,但对其它B细胞亚群影响不显著。这种效应可能与细胞内p38/MAPK信号通路有关。2.记忆B细胞可经RANKL途径调控破骨细胞分化,并藉此调节牙槽骨稳定性,影响牙周炎的病理过程。