论文部分内容阅读
p93基因(GenBanka.c.为AF116826)是本室从成人心脏和主动脉cDNA文库中通过大规模分离筛选新的ESTs(expressedsequencetags)克隆到的一个新基因。该基因定位在1p21-31(此区域与房室间隔缺损相关)，其cDNA全长约3420bp，含一个2505bp的完整阅读框，编码835个氨基酸，此蛋白分子量约为93kD，故命名为p93。结构域组成分析表明p93含三种结构域：N端为7个锚蛋白重复(ankyrinrepeats，ANK)结构域，中间为一蛋白激酶(proteinkinase，PK)结构域，C末端为富含丝氨酸(Ser-rich)结构域；种系发生分析发现p93属MLK(mixedlineagekinase)家族成员。胎儿6种组织、成人8种组织的Northernblot结果和76种组织的多组织点阵膜的杂交结果都证实p93基因仅在成人及胎儿心脏表达；心肌组织的免疫组织化学染色结果亦显示p93仅在胎儿和成人心肌细胞内表达；体外激酶活性分析结果证实p93可发生自身磷酸化。
大量前期研究表明，p93是一个新发现的心肌特异性表达的有功能的蛋白激酶，推测该基因与心脏发育和心肌病关系密切，但目前尚无直接的临床证据证明p93与心血管疾病之间存在的紧密联系；该基因的作用机制和激酶通路也不甚明了；也无恰当的动物模型来直观、有效地阐明该基因在心脏发育中的作用及其机制。为解决上述问题，本课题分别在血清学水平、细胞学水平和整体水平对p93基因的功能进行了更深入的研究与探讨：
1.p93血清水平的测定及其临床意义首先建立了一个准确性高、可信度大、重复性好的ELISA实验条件，在此基础上检测正常人、冠状动脉粥样硬化性心脏病、扩张性心肌病、风湿性心脏病和先天性心脏病患者的p93血清水平并比较其差异，结果显示正常人和患者血清中均可检测到P93抗原，说明正常和疾病状态下均有P93分泌入血；冠心病等4种心血管疾病患者的p93血清水平均高于正常对照组；先心病组p93血清水平高于冠心病组。最后，得出如下结论：p93基因与冠状动脉粥样硬化性心脏病、扩张性心肌病、风湿性心脏病和先天性心脏病密切相关，可能在上述各疾病的发生、发展过程中起着重要作用。
2.p93基因的信号通路与在心肌细胞凋亡中的作用培养原代新生大鼠心室肌细胞，感染携带有p93、反义p93、p93突变体重组腺病毒和空载体腺病毒48h后，可见Ad-p93组损伤不明显，而其它病毒感染组均有不同程度损伤。上述细胞经Hoechest染色显示Ad-p93组只有轻度的染色质边集，其它病毒感染组心肌细胞均出现不同程度的细胞核的固缩、染色质边集、核碎裂现象，有少量细胞出现典型的凋亡小体结构，说明p93基因具有抑制凋亡的作用。收集感染后细胞蛋白经WesternBlot检测发现JNKs和p38磷酸化蛋白量是一致的，而Ad-p93组磷酸化ERKs蛋白量增高，表明p93基因过表达引起ERK通路磷酸化水平提高，其它通路磷酸化水平无明显差异。故得出以下结论：p93基因可能对心肌细胞损伤具有保护作用；P93激酶的下游通路是ERK通路，其通过磷酸化ERK通路来达到抑制凋亡、保护心肌细胞的作用。
3.利用鸡胚模型初探p93基因在心脏发育过程中的作用首先，成功建立了一套成熟的鸡胚培养条件和鸡胚心脏显微注射的技术平台，为本课题组后期心脏发育的研究提供了一种简便实用的技术手段。通过生物信息学分析，发现一个鸡来源的、与人p93基因高度同源的预测基因，但是经反复WesternBlot实验只检测到一条与预测基因大小(190.7KD)不一致的蛋白条带(约为80KD)，该条带经质谱分析，结果显示其并非鸡p93同源蛋白，故本部分工作暂且搁置。但该部分工作，尤其是鸡胚心脏显微注射技术平台的建立，为后期实验的继续进行奠定了扎实的基础；而且，对于利用RNAi方法在动物模型中进行p93基因功能的研究是一项有意义的尝试。