不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFAs)是膜的重要组成成分以及信号分子的前体物质。正常不饱和脂肪酸的摄入不足与代谢被中断常常引发人的某些疾病，如冠状动脉疾病、高血压、糖尿病、炎症紊乱以及癌症(Simopoulos，AP 1999)。人体中n-3多不饱和脂肪酸含量是不足的，而n-6多不饱和脂肪酸的含量相对偏高，n-6/n-3含量比例约为18：1。其中N-3不饱和脂肪酸对于正常的细胞功能运作起着重要作用，目前研究表明n-3不饱和脂肪酸在疾病的预防和治疗中发挥了巨大的作用。然而在单胃动物和人体中自身缺乏C9位引入双键的去饱和酶而无法正常合成n-3不饱和脂肪酸。仅仅通过饮食摄取足量的n-3PUFAs的效率很低，很难满足机体的需要，这就使得在哺乳动物体内增加外源性的n 3PUFAs脱氢酶成为一个可取的途径。研究发现线虫的fat-1基因能够编码合成n-3脂肪酸脱氢酶，可以在不饱和脂肪酸的氢链上添加一个双键，将n-6脂肪酸降解为多数动物体内所缺乏的n-3脂肪酸，有效地提高动物体内n-3不饱和脂肪酸的含量，平衡体内n-6不饱和脂肪酸与n-3不饱和脂肪酸的比例。 为了构建具有多功能、高活性新型融合基因，并获得融合蛋白，本实验应用PCR技术对线虫的不饱和脂肪酸脱氢酶sFatl基因加以改造。根据编码sFatl基因的cDNA碱基序列，设计并人工合成了两条引物，在5’端引入BamHT和PstI位点和启动子ATG序列，在3’端引入SaII以及终止子TAA。克隆PCR产物，并构建了pGMFat—1重组质粒。经BamHI，SalI酶切及质粒PCR鉴定，证实sFatl基因已克隆到原核表达载体pGEX-4T-1，为进一步研究其诱导表达条件及生物学功能奠定了基础。将已构建的pGMFat—1质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，用2×YTA培养基培养，以IPTG诱导融合蛋白表达，并作RT—PCR及SDS—PAGE分析转录及表达情况。RT—PCR结果显示，该融合蛋白能在大肠杆菌中正确转录，且经SDS—PAGE分析表达蛋白分子量为46KD。 在分析原核表达重组子pGMFat—1性质的基础上，构建了MFat-1基因的真核重组质粒。将MFat-1基因亚克隆到真核非分泌型表达载体vR1012中，通过酶切分析，筛选到插入正确的重组真核表达质粒VRMFat-1。以重组真核表达质粒包装转染真核细胞，实验结果表明：，经RT—PCR分析证实MFat—1基因转染细胞的总RNA中含有MFat-1基因的mRNA，证明MFat-1获得转录表达。这些为深入开展VRMFat-1在体内表达和调节动物的生长代谢奠定了良好的基础。