真菌性角膜炎(fungal keratitis， FK)是一种多发于热带及亚热带地区的感染性角膜病变，发病率极高，且有极高的致盲率。尤其是在发展中国家，FK为最常见的致盲性眼病之一，其发病率在各种严重感染性角膜病变中甚至可以居于首位。　　FK的病因多种多样，在发达国家，该病最常见的诱因为佩戴角膜接触镜;而在发展中国家，该病的主要诱因则是角膜外伤，尤其是植物性角膜外伤。在世界范围内，FK的致病真菌有七十余种，其中最常见的是镰刀菌属真菌和曲霉菌属真菌。临床数据表明，与其它真菌引起的角膜炎相比，曲霉菌性角膜炎具有诊断率低、药物治疗效果差、手术治疗需求率高、预后不良和复发率高等特点，已成为目前临床上最为棘手的FK之一。因此，本研究选用烟曲霉菌(Aspergillusfumigatus， A.fumigatus)构建FK的动物模型并进行相关研究，这具有重要的理论价值和临床意义。　　FK病情进展迅速且预后相对不良，因此必须进行及时的诊断和有效的治疗，否则就有可能出现前房积脓、角膜穿孔、恶性青光眼或真菌性眼内炎等症状，甚至导致失明乃至眼球摘除的后果。目前的相关研究已经表明，在FK的过程中，机体的免疫功能是抵抗真菌感染的重要因素。因此，想要研究FK，就需要深入探究疾病发生发展过程中角膜的免疫防御体系。　　角膜由外向内依次分五层结构，角膜上皮细胞(cornal epithelial cell，CEC)因为居于角膜的最表面，因而成为了角膜抵挡病原微生物入侵的第一重生物学防线。病原微生物侵犯角膜组织时，CEC可以通过其上的Toll样受体(Toll likereceptors， TLRs)和NOD样受体(NOD like receptors，NLRs)等重要的模式识别受体(pattern recognition receptors， PRRs)识别病原微生物表面的病原体相关分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMPs)，从而启动下游的免疫反应，发挥抵抗病原微生物入侵的作用。我们的前期研究已经表明，在A.fumigatus性角膜炎发生发展的过程中，CEC表面上的TLR2和TLR4受体可以接受A.fumigatus的刺激并对它们进行识别，激活核转录因子-κB(nuclear factorκB，NF-κB)并启动NF-κB下游的信号通路，释放白细胞介素(interleukin，IL)-6，IL-8，IL-10，IL-1β和TNF-α等细胞因子以及hBD2和LL37等抗菌肽，并通过与NOD1和NOD2的交互作用参与免疫反应。　　本研究的结果表明，在角膜A.fumigatus感染的过程中，TSLP促进DCs聚集、活化、成熟和迁移;成熟的DCs分泌Th2细胞趋化因子，促进促炎因子和Th2细胞因子的分泌，诱导Th2型炎症反应。这有助于我们深入了解FK过程中获得性免疫反应的机理，为防治FK提供了新的理论基础和思考方向，具有重要的理论意义和临床价值。　　本文主要从以下几方面进行论述：　　第一部分 烟曲霉菌角膜感染介导DCs诱导Th2型炎症反应的实验研究　　目的：　　研究A.fumigatus角膜炎中，树突状细胞(dendritic cells，DCs)参与免疫反应并诱导Th2型炎症反应的过程。　　方法：　　1.用针头在野生型C57BL/6(B6)小鼠的角膜中央划出三道长度为1mm的划痕，用A.fumigatus菌液感染小鼠，将封口膜修剪成适合的角膜接触镜，置于小鼠角膜表面，并缝合小鼠眼睑，24小时后取出接触镜。在感染后0.5d，1d，3d，5d和7d于裂隙灯下观察感染情况，并进行临床评分，PBS处理的小鼠作为阴性对照组，未经处理的小鼠作为空白对照组;　　2.PCR检测感染不同时期小鼠角膜DCs的表达，PCR和Western blot检测感染不同时期小鼠角膜CD11c+DCs的成熟情况，免疫荧光检测感染不同时期小鼠角膜DCs的聚集、迁移和成熟，以及成熟DCs的迁移;　　3.PCR和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测感染不同时期小鼠角膜DCs分泌的Th2细胞趋化因子TARC和MDC的表达情况，PCR和ELISA检测感染不同时期小鼠角膜促炎因子TNF-α和Th2细胞因子IL-4，IL-5和IL-13的表达情况，并进行统计学分析。　　结果：　　随着感染的进行，角膜溃疡逐渐加重，而后逐渐减轻并形成瘢痕愈合。在感染的过程中，DCs聚集、成熟，由基底膜向角膜上皮层迁移，同时由角膜缘向角膜中心迁移，并于感染早期分泌TARC和MDC，于感染中晚期诱导促炎因子TNF-α和Th2细胞因子IL-4，IL-5和IL-13的表达。　　结论：　　在A.fumigatus角膜炎的过程中，角膜中的DCs聚集，逐渐成熟并迁移，表达OX40L激活CD4+T细胞，分泌TARC和MDC发挥Th2趋化作用，并于感染中晚期诱导促炎因子TNF-α和Th2细胞因子IL-4，IL-5和IL-13的表达，诱导Th2型炎症反应。　　第二部分 烟曲霉菌角膜感染介导TSLP活化DCs诱导Th2型炎症反应的实验研究　　目的：　　研究A.fumigatus角膜炎中，TSLP对DCs参与的免疫反应及其诱导的Th2型炎症反应的影响。　　方法：　　1.野生型C57BL/6(B6)小鼠结膜下注射TSLP小干扰RNA(TSLP siRNA)，乱序小干扰RNA，人重组TSLP蛋白(rTSLP)和IgG预处理。用针头在小鼠的角膜中央划出三道长度为1mm的划痕，用A.fumigatus菌液感染小鼠，将封口膜修剪成适合的角膜接触镜，置于小鼠角膜表面，缝合小鼠眼睑，并于感染后1d拆除缝线，于裂隙灯下观察感染情况，并进行临床评分，普通感染的小鼠作为对照组;　　2.PCR和Western blot检测不同处理组中小鼠角膜成熟DCs的表达情况，免疫荧光检测不同处理组中小鼠角膜成熟DCs水平迁移和垂直迁移情况;　　3.PCR和ELISA检测不同处理组中小鼠角膜DCs分泌的Th2细胞趋化因子TARC和MDC的表达情况，PCR和ELISA检测不同处理组中小鼠角膜促炎因子TNF-α和Th2细胞因子IL-4，IL-5和IL-13的表达情况，PCR和ELISA检测不同处理组中小鼠角膜Th1细胞因子IFN-γ和Th17细胞因子IL-17的表达情况，并进行统计学分析。　　结果：　　与普通感染组小鼠相比，TSLP siRNA组中TSLP的表达显著下降，rTSLP组中TSLP的表达显著增加。TSLP siRNA组中小鼠角膜炎症情况显著减轻，rTSLP组中小鼠角膜炎症情况显著加重。　　TSLP siRNA组中TSLPR和OX40L的表达显著下降，rTSLP组中TSLPR和OX40L的表达显著增加。TSLP siRNA组中，成熟DCs的数量减少，迁移速率减慢，在角膜缘、角膜中间区和角膜中央区的数量均减少;rTSLP组中，成熟DCs的数量增加，迁移速率加快，在角膜缘、角膜中间区和角膜中央区的数量均增加。　　TSLP siRNA组中TARC和MDC的表达显著下降，rTSLP组中TARC和MDC的表达显著增加。TSLP siRNA组中TNF-α，IL-4，IL-5和IL-13的表达显著下降，rTSLP组中TNF-α，IL-4，IL-5和IL-13的表达显著增加。TSLP的变化对IFN-γ和IL-17表达没有显著影响。　　结论：　　在A.fumigatus角膜炎的过程中，TSLP促进角膜中的DCs聚集，促进DCs表达OX40L成熟并迁移，促进DCs分泌TARC和MDC发挥Th2趋化作用，并于感染中晚期诱导促炎因子TNF-α和Th2细胞因子IL-4，IL-5和IL-13的表达，诱导Th2型炎症反应。