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目的:放射治疗是结直肠癌（CRC）常规新辅助治疗方法之一,但近三分之一CRC患者对放疗表现出低敏感性或者完全抵抗。由于癌细胞可以识别放射治疗中电离辐射诱导的DNA损伤,并通过激活各种途径修复损伤,具有较高的修复活性,成为发生放疗抵抗的重要原因。DNA损伤反应是一种精确的信号级联系统,可以检测到DNA损伤并决定受损细胞的命运,在肿瘤的放疗敏感性中起关键作用。高能射线辐射可造成包括碱基损伤、单链断裂和双链断裂等DNA损伤,其中双链断裂（DSB）最为严重,可破坏DNA双链结构,干扰DNA复制,甚至引起细胞死亡。DSB由包括同源重组和非同源末端连接在内的双链断裂修复系统（DSBR）所修复。此外研究表明放疗不但可诱导肿瘤细胞的DNA损伤反应直接杀死肿瘤细胞,而且受辐射的肿瘤通过介导免疫机制抑制未经照射的转移性肿瘤细胞,这种免疫机制的激活有助于其他部位转移肿瘤的清除,但相关机制尚未阐明。据报道适应性免疫反应和先天性免疫反应通路cGAS-STING可感知放疗后胞质内的双链DNA（dsDNA）,并被激活,推测其可激活抗肿瘤天然免疫机制提高放疗疗效。MicroRNA（miRNA）几乎参与肿瘤发生发展的全过程,也是预测放疗敏感性的重要生物分子标志,而由外泌体包裹的miRNA由于受到囊泡保护,不易分解,性质稳定,同时可转移到远端仍保持功能。此外,胞质内的dsDNA亦可被外泌体包裹传递,激活相邻或远隔肿瘤细胞或免疫细胞的cGAS-STING通路进而诱发旁观者效应。因此本研究通过生物信息学筛选、经放射治疗结直肠癌病例分析、体外细胞功能验证相结合的方法探讨DNA双链断裂损伤修复基因及相关miRNA影响CRC放疗敏感性的作用,及其与cGAS-STING天然免疫通路的关联,同时分析外泌体包裹的miRNA及dsDNA能否传递相邻细胞或诱发远隔细胞的旁观者效应,激活cGAS-STING通路,保持其生物学作用,增加放疗疗效。本研究以高能辐射所致DNA损伤为模型探讨基因组不稳定性诱导天然免疫反应的遗传毒理学机制,同时为找寻意义确切的结直肠癌新辅助放射治疗的分子效应靶点及预后生物标志提供新的实验依据和科学线索。研究方法:1、结直肠癌病例分析放疗抵抗相关的DSBR基因及其与cGAS-STING通路的关联:（1）收集行放射治疗的结直肠癌病例30例,记录放疗前、后患者病理特征,使用Mandard肿瘤退化分级评分对CRC放疗效果进行评价,分为CRC放疗敏感组和抵抗组。（2）qPCR检测放疗敏感及抵抗组CRC患者血浆中DSBR关键基因的m RNA表达水平;ELISA检测蛋白水平,探讨DBSR基因与放疗抵抗的关联。（3）使用Quant-i TTMPico Green（?）dsDNA试剂盒检测敏感、抵抗组患者dsDNA水平;（4）qPCR检测两组cGAS、STING、IRF3 m RNA水平,ELISA检测蛋白水平,探讨cGAS-STING通路的活性与放疗抵抗的关联。2、DSBR关键基因RAD51及BRCA1相关miRNA影响放射敏感性及其与cGAS-STING通路的关联:（1）生物信息学网站筛查同时调控RAD51、BRCA1的miRNA,并在CRC病例血浆样本中验证,分析其与RAD51和BRCA1表达的相关性。（2）放射敏感与抵抗CRC细胞的筛选及验证:CCK8实验检测经照射后HCT116及SW480细胞的活性;克隆形成实验检测克隆形成能力;γH2AX免疫荧光实验检测两种细胞经照射后DNA损伤修复程度,明确两种细胞对辐射敏感程度的不同。（3）qPCR和Western blot检测两种细胞RAD51及BRCA1的m RNA及蛋白水平,并检测调控RAD51和BRCA1的miRNA表达情况,分析其关联性。（4）检测两种细胞的dsDNA水平及cGAS、STING、IRF3表达水平,分析两者的关联性。（5）在两种细胞转染miRNA模拟物及抑制剂后,经照射处理,应用CCK-8、克隆形成及γH2AX免疫荧光实验以明确miRNA对放射敏感性的影响;检测cGAS、STING、IRF3的m RNA和蛋白水平,明确该通路的激活。3、外泌体miRNA及dsDNA影响CRC细胞的辐射敏感性:（1）使用电镜对外泌体进行鉴定,检测患者血清及细胞上清液外泌体中miRNA及dsDNA表达水平。（2）转染miRNA模拟物后收集细胞上清液与细胞共培养或经Transwell共培养,探讨外泌体能否通过接触或非接触形式传递内容物;CCK8、克隆形成实验检测辐射敏感性、检测RAD51和BRCA1表达水平,明确外泌体中miRNA能否在细胞间传递,影响辐射所致DNA损伤与修复。（3）检测cGAS、STING、IRF3 m RNA和蛋白水平,明确外泌体miRNA及dsDNA能否与肿瘤天然免疫通路发生关联。结果:1、结直肠癌放疗抵抗与双链断裂修复通路关键基因RAD51和BRCA1的表达水平相关联,影响cGAS-STING通路的活性:（1）放疗敏感的CRC患者血浆样本中,RAD51和BRCA1基因表达明显低于放疗抵抗组（P＜0.05）,即DNA修复能力越强越容易发生放疗抵抗。（2）放疗敏感组CRC患者的dsDNA水平明显高于抵抗组,cGAS、STING、IRF3及p IRF3蛋白表达水平较抵抗组高（P＜0.05）,即DNA损伤程度越重,cGAS-STING通路活性越高。2、调控RAD51及BRCA1基因表达miRNA与放疗抵抗的关联:（1）miRtar Base等数据库预测miR-192-5p、miR-193b-3p、miR-215-5p、miR-28-5p可与RAD51和BRCA1结合,在CRC患者血样验证miRNA表达与RAD51及BRCA1基因表达呈负相关;其在敏感组水平显著低于抵抗组（P＜0.05）。（2）HCT116和SW480细胞对辐射敏感性不同,对放射较敏感的HCT116细胞中miR-192-5p、miR-193b-3b和miR-28-5p高表达,RAD51和BRCA1呈低表达（P＜0.05）;高表达RAD51和BRCA1增加DNA损伤修复,抑制了cGAS-STING通路的激活（P＜0.05）。（3）无论抵抗还是敏感细胞经照射后miRNA表达水平降低,而RAD51和BRCA1表达水平上调（P＜0.05）。（4）转染miRNA模拟物后,只有miR-193b-3p可以抑制RAD51和BRCA1表达水平,双荧光素酶实验证实miR-193b-3p可以与RAD51和BRCA1的3’UTR区结合,靶向调控RAD51和BRCA1。（5）细胞转染miR-193b-3p模拟物后经照射,细胞活力、克隆形成能力均下降,FOCI点明显增加（P＜0.05）,cGAS-STING通路被激活,而转染抑制剂后结果呈现相反趋势,说明miR-193b-3p影响肿瘤细胞的放射敏感性。3、外泌体携带的miR-193b-3p及dsDNA能够增加细胞放射敏感性和激活cGAS-STING通路活性:（1）电镜观察验证提取成功的外泌体形态,且放疗敏感组患者血清外泌体中的dsDNA明显高于放疗抵抗组,miR-193b-3p表达水平呈现放疗抵抗组低表达,敏感组高表达的趋势（P＜0.05）。（2）转染miR-193b-3p模拟物后收集细胞上清液提取外泌体,与细胞共培养发现细胞中miR-193b-3p水平升高,说明外泌体能够向邻近细胞传递miR-193b-3p发挥生物学功能。Transwell实验发现Cy3标记的193b-3p-exo能够进入下层细胞,提示外泌体可以通过非接触形式向远端细胞传递内容物。（3）193b-3p-exo可调控RAD51、BRCA1表达,增加细胞放射敏感性,同时外泌体中dsDNA可传递至邻近细胞或远隔细胞,协同激活cGAS-STING通路。结论:1、结直肠癌病例分析提示双链断裂修复关键基因RAD51、BRCA1表达升高与放疗抵抗相关联,同时cGAS-STING天然免疫通路活性受到抑制。2、生物信息学及结直肠癌病例分析提示miR-192-5p、miR-193b-3p和miR-28-5p通过影响RAD51、BRCA1基因与放疗抵抗相关联。其中miR-193b-3p可同时与RAD51和BRCA1结合,抑制RAD51、BRCA1蛋白表达,增加放射敏感性;激活cGAS-STING天然免疫通路。3、外泌体可携带miR-193b-3p及dsDNA遗传物质传递相邻细胞或远隔细胞,miR-193b-3p通过调控RAD51和BRCA1基因抑制其蛋白表达,降低DNA修复功能;同时miR-193b-3p及dsDNA可激活cGAS-STING天然免疫通路,通过直接接触和非接触的旁观者效应共同促进放射敏感性。