第一部分KLK1对衰老前列腺的影响背景及目的:良性前列腺增生（benign prostate hyperplasia,BPH）及其引发的下尿路症状在老年男性中十分常见,具体发病机制尚未完全阐明,当前一线药物未能遏制部分病人疾病进展。本科研小组成员在前期研究中发现相比于老年野生大鼠,高表达人类种属组织激肽释放酶（tissue kallikrein,KLK1）的老年转基因大鼠前列腺外观更接近青年野生大鼠,由此推测KLK1可能减缓前列腺器官的衰老。本部分研究旨在了解KLK1对老年大鼠前列腺的具体作用效应及相关机制。方法:本部分共纳入30只大鼠,其中10只纯合子人类KLK1转基因大鼠来自德国柏林Max-Delbrück分子医学中心的慷慨馈赠。动物分为3组,分别为自然衰老的老年野生大鼠组（18月龄）和老年转基因大鼠组（18月龄）,以及作为正常对照的青年野生大鼠组（3月龄）。每组10只,均自然生长,无特殊干预。通过常规病理染色、免疫组化、实时定量PCR、Western Blot、ELISA等实验,检测各组大鼠前列腺的病理表现、人类和大鼠种属的KLK1表达、氧化应激程度,以及内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase,e NOS）相关的一氧化氮（nitric oxide,NO）合成途径、环氧合酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）相关的花生四烯酸代谢途径和转化生长因子β1（transforming growth factorβ1,TGF-β1）相关的纤维化途径的关键因子。此外,收集47例BPH患者前列腺术后样本进行常规病理染色和免疫组化,以分析KLK1表达水平与患者年龄以及前列腺纤维化程度的关系。结果:DNA、RNA和蛋白水平的检测均显示仅转基因大鼠表达人类KLK1基因,野生型大鼠均不表达该基因。RNA和蛋白水平检测发现两组老年大鼠前列腺中大鼠种属KLK1基因表达均低于青年野生大鼠。病理染色显示,老年野生大鼠前列腺中普遍存在腺上皮萎缩、腺管周围平滑肌增厚、炎症细胞浸润增加、细胞外基质沉积等病理改变,而在老年转基因大鼠前列腺中观察到上述病理改变减轻。并且较之于老年野生大鼠,老年转基因大鼠前列腺内下列途径发生改变:（1）在NO合成途径中,二甲基精氨酸二甲胺基水解酶2表达增加,对e NOS有抑制作用的非对称型二甲基精氨酸含量降低,e NOS/NO/环磷酸鸟苷上调;（2）在花生四烯酸代谢途径中,COX-2及前列环素合成酶表达上调,环磷酸腺苷含量上调;（3）在纤维化途径中,TGF-β1表达被抑制,及ras同源家族成员A（ras homolog family member A,Rho A）/Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶1（Rho associated coiled-coil containing protein kinase 1,ROCK1）下调,I型和III型胶原蛋白合成降低。在BPH患者前列腺术后样本中发现KLK1表达随着年龄增长而降低,但前列腺纤维化程度分别与年龄和KLK1表达水平在统计学上都没有显著的相关性。结论:衰老过程中前列腺局部KLK1表达逐渐降低,而上调KLK1表达将有助于改善大鼠衰老后前列腺中相关病理改变,减轻氧化应激和纤维化。衰老引起大鼠前列腺内TGF-β1/Rho A/ROCK1途径上调,DDAH2/e NOS/NO/c GMP和COX-2/PTGIS/c AMP途径下调,造成局部微循环障碍及组织纤维化,而KLK1可能通过恢复上述途径来减缓转基因大鼠前列腺的衰老。第二部分KLK1抑制前列腺纤维化的体外机制研究背景及目的:TGF-β1诱导成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞,后者在纤维化的过程中发挥重要作用。根据在转基因大鼠中的发现,本部分研究旨在通过体外实验研究KLK1通过影响NO合成途径和TGF-β1相关的纤维化途径而保护前列腺的具体过程,以及了解KLK1下游的缓激肽（bradykinin,BK）对前列腺造成的直接效应。方法:提取健康性成熟野生雄性大鼠（3月龄）的原代前列腺成纤维细胞与原代主动脉内皮细胞（作为前列腺内皮细胞的代替）,并通过细胞标志物鉴定其表型。分别以平滑肌肌动蛋白α（αsmooth muscle actin,α-SMA）表达作为转分化实现的标志,研究TGF-β1诱导原代成纤维细胞向肌成纤维细胞表型转分化的效应;以e NOS/NO上调为BK形成并发挥作用的标志,验证KLK1联合其底物低分子量激肽原对原代内皮细胞的作用效应。构建成纤维细胞-内皮细胞共培养系统,研究KLK1对TGF-β1诱导的转分化过程的具体影响过程。通过免疫荧光检测正常人前列腺上皮细胞系RWPE-1和基质细胞系WPMY-1,以及原代大鼠前列腺成纤维细胞中缓激肽B2型受体（B2 bradykinin receptor,BKRB2）的表达情况。利用浓度跨度为10 n M~1μM的BK处理上述细胞,检测细胞增殖活力以及TGF-β1和i NOS表达水平。结果:成功提取了纯度足够的大鼠原代前列腺成纤维细胞和原代主动脉内皮细胞。TGF-β1可以诱导原代成纤维细胞转分化为高表达α-SMA的肌成纤维细胞。KLK1与其底物低分子量激肽原的共同干预,以及直接BK单独干预均可以使原代主动脉内皮细胞上调e NOS/NO。在共培养系统中,KLK1联合LMWK抑制TGF-β1诱导原代成纤维细胞表达α-SMA,但该效应被BKRB2特异性拮抗剂HOE-140阻断,作为NO供体的硝普钠同样可以抑制TGF-β1的作用。RWPE-1基本不表达BKRB2,而WPMY-1和原代成纤维细胞表达BKRB2。10 n M~1μM浓度的BK均不上调RWPE-1的增殖活力,但可以刺激WPMY-1和原代成纤维细胞的增殖,但幅度均较低且相近。10 n M BK处理WPMY-1和原代成纤维细胞均使TGF-β1表达下调,i NOS表达上调。结论:KLK1对抗TGF-β1诱导的转分化机制在于通过裂解低分子量激肽原产生BK,后者活化内皮细胞的BKRB2引起e NOS/NO上调,NO扩散至前列腺基质,抑制TGF-β1的效果。BK对前列腺不造成明显的促增殖效果,甚至可能直接抑制纤维化相关基因表达。第三部分KLK1对BPH炎症机制的影响背景及目的:最新的观点认为,漫长的BPH发生发展过程中,各种外界刺激导致前列腺内复杂的免疫网络发生紊乱,上调的炎症因子/生长因子及受累而表型改变的各类细胞促使了前列腺增生的发生及临床进展。本部分研究旨在初步探索KLK1是否改善前列腺的炎症损伤及其中机制。方法:分析第一部分研究中收集的BPH患者术后前列腺组织中KLK1表达和前列腺炎症程度的关系。在动物实验中通过大鼠前列腺自身抗原和弗氏完全佐剂构建慢性自身免疫性前列腺炎（experimental autoimmune prostatitis,EAP）大鼠模型并进行KLK1静脉给药,分为预实验和正式实验两部分。预实验中,分别设置给药组与模型组,比较KLK1在造模同期给药以及造模完成后给药的疗效差异,根据结果确定正式实验的KLK1给药时机。正式实验中,12周龄的雄性Wistar大鼠分为5组,分别为正常对照组、正常对照+KLK1组、EAP组、EAP+KLK1组、EAP+KLK1+HOE-140组。每组6只,给药持续6周。通过常规病理染色、免疫组化、细胞因子阵列等检测各组大鼠前列腺中病理表现、炎症特征、微血管密度、纤维化、氧化应激以及KLK1表达的变化,通过实时定量PCR、Western Blot检测相关的信号途径的关键因子的表达改变。结果:BPH患者前列腺术后样本中伴有明显炎症者相比于不伴明显炎症者KLK1表达降低。动物实验的预实验表明KLK1给药与EAP造模同期进行可以更好地缓解前列腺的炎症损伤。在正式实验中,仅进行KLK1给药的正常大鼠前列腺未出现明显病理改变,EAP大鼠前列腺出现严重的炎症细胞浸润,并伴有局部上皮萎缩、基质纤维化、微血管增生等病变,而KLK1以依赖于BKRB2的方式缓解上述前列腺病变,减少T淋巴细胞和巨噬细胞的浸润,降低多种与BPH相关的炎症因子/生长因子表达,并减轻氧化应激。具体的分子机制改变在于,较之EAP模型,与造模同期进行的KLK1给药下调前列腺中TGF-β1/Rho A/ROCK1/α-SMA表达,抑制I型和III型胶原蛋白合成,并伴随有缺氧诱导因子α和内皮细胞生长因子下调,及e NOS上调。结论:慢性炎症导致前列腺缺氧、氧化应激、微血管增生和纤维化,伴随多种与BPH相关的炎症因子/生长因子上调。KLK1可通过BK活化内皮细胞中BKRB2并上调e NOS/NO,NO通过保护微循环及对抗TGF-β1相关的纤维化进程,对上述前列腺炎性损伤发挥改善作用。且短期KLK1给药并不对前列腺造成明显负面影响。