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目的：神经损伤后神经末梢和受损的细胞释放大量的ATP，ATP激活脊髓小胶质细胞膜上P2X4受体，促使小胶质细胞释放大量炎性介质，如IL-1，IL-6，TNF等，是神经病理性痛发生的主要机制之一。P2X4受体作为信号转导通路中的一个关键环节，日益受到研究关注。目前研究已证实向正常大鼠鞘内注入P2X4受体已被激活的小胶质细胞可引发异常疼痛，而注入P2X4受体基因的反义寡核苷酸片段能减轻此种疼痛。本实验筛选永生化小鼠小胶质细胞特异性P2X4siRNA，并将其转染至永生化小鼠小胶质细胞，鉴定其表达，并探讨下调P2X4对永生化小鼠小胶质细胞活化的影响。
方法：
1. 特异性P2X4siRNA的筛选及鉴定转染FAM-siRNA 16 h后，激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)检测永生化小鼠小胶质细胞转染效率；设计3条特异性siRNA经lipofectamine 2000介导转染永生化小鼠小胶质细胞，72 h后半定量RT-PCR观察干扰前后P2X4基因mRNA水平表达，比较对应不同位点的三对siRNA片段对P2X4基因的干扰效果，分析RNA干扰的特异性，从中筛选出特异性最高的一条siRNA；转染该序列72 h后Western blot检测P2X4的表达。
2. 下调P2X4基因表达对永生化小鼠小胶质细胞活化的影响体外培养永生化小鼠小胶质细胞，随机分为3组：空白对照组、阴性对照组、转染siRNA-F1组。空白对照组未进行任何干预，阴性对照组转染N control siRNA，转染siRNA-F1组转染先前筛选出来的1条特异性siRNA。72 h后，用50 μM ATP刺激，采用LSCM检测胞内钙离子浓度(intracellular calcium concentration，[Ca2+]I)，P2X4R/OX42免疫荧光双标染色观察细胞形态。
结果：
1.激光扫描共聚焦显微镜显示转染效率达80[％]；三对siRNA片段中siRNA-F1的沉默效率最高，最大干扰效率达72.2％；Western blot显示转染siRNA-F1后P2X4蛋白表达下调。
2.转染siRNA-F1组ATP活化小胶质细胞后，胞内钙离子释放较阴性对照组和空白对照组减少；P2X4R/OX42免疫荧光双标染色显示转染siRNA-F1组细胞存在活化态小胶质细胞和静息态小胶质细胞，而空白对照组和阴性对照组只存在活化态小胶质细胞。
结论：
成功筛选出一条特异性 P2X4siRNA—siRNA-F1，能够下调永生化小鼠小胶质细胞P2X4的表达。并且siRNA-F1能部分抑制永生化小鼠小胶质细胞的活化。