前言：　　 汉坦病毒(hanta vims,HV)可引起一种以发热、出血、肾功能损害和免疫功能紊乱为突出表现的急性传染性疾病,即肾综合征出血热(Hemorrhagic feverwith renal syndrome,HFRS)。我国是受汉坦病毒危害最为严重的国家,发病人数占全球总数的90%以上。HFRs的发病机制复杂,好发人群多为青壮年,并发症多,病死率高达1～15%。目前HFRS的诊断和抗病毒药物仍未取得令人满意的效果,造成本病的误诊、漏诊及无特效的治疗方法,致使死亡率居高不下。鉴于抗体(antibody,Ab)对抗原(anti gen,Ag)的特异性识别是多数疾病诊断和治疗的基础,病毒性疾病尤其如此,因此开发新型基因工程抗体是提高HFRS诊断敏感性及治疗效果的重要途径。　　 近年来,治疗性单克隆抗体(monoclonalantibodies,mAbs)发展迅速,已成为免疫治疗的重要手段。据统计,目前有25个mAbs已经被批准应用于临床治疗,超过200个mAbs已在临床实验阶段,并且保持着每年约14%的增长率。噬菌体抗体库技术是研制mAbs的有效方法,其利用基因工程的方法将全套人抗体重链及轻链可变区基因克隆出来,并在噬菌体表面表达、分泌,经筛选后获得特异性抗体。应用噬菌体抗体库技术,国内外学者已先后建立起了多种抗体库。但是,由于多数病毒抗原表位复杂,病毒变异快,致病机理复杂以及噬菌体抗体本身存在的亲和力相对较低等原因,目前还没有噬菌体抗体用于病毒性疾病临床治疗的报道。　　 抗体库的亲和筛选主要依赖于抗体库中抗体的亲和性和多样性,保持抗体的高亲和力可避免与其他抗原非特异性结合而引起的副作用。抗体亲和力大体和库容成正比,因此建立大库容的抗体库是获得高亲和性抗体的首要任务。抗体重链(heavychainvariableregion,VH)及轻链(lightchainvariableregion,VL)可变区基因的扩增是获得高容量噬菌体抗体库及分析抗体功能的关键步骤。为了大量扩增抗体基因片段,研究者根据抗体中某些序列的相对保守性设计一系列相应引物,利用不同的PCR技术简单有效地扩增出全套抗体可变区(variableregion,V/FV)基因。一旦多样的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)可变区基因能够扩增,从噬菌体抗体库中即能得到针对不同抗原的特异性抗体。许多研究者试图通过设计通用引物或一套引物扩增人全部可变区基因序列,如应用Sblattero设计的引物扩增可变区基因建立抗体库,但这些研究中的引物是根据当时的人Ig数据库设计的。近年来,数据库中胚系基因序列的不断更新,使得胚系基因的数量及多样性有了很大提高,所以这些引物已经不能涵盖现今数据库中的全部Ig可变区基因。　　 本研究拟根据最新的国际免疫遗传学数据库(theinternationalImMunoGene-Ticsinformationsystem,IMGT)和IgBLAST数据库的胚系基因序列,通过开放的简并引物设计平台iCODEHOP和手动设计两种方式设计新的可变区基因引物,对获得的可变区基因的多样性及单链抗体(SinglechainFvfragment,ScFv)的连接效率进行分析,为构建大容量抗汉坦病毒免疫噬菌体抗体库以及筛选获得可用于HFRS患者快速诊断和免疫治疗的高亲和力抗体奠定基础。　　 方法：　　 一、VH基因的引物设计　　 首先,从IMGT和IgBLAST数据库获得了全部胚系基因序列,根据编码VH基因框架区(Frameworkregion,FR)1的胚系基因V片段(VH)基因家族的不同,分成7组VH(229个蛋白序列)。然后应用BlockMaker服务器将同一家族内的序列进行比对,找出高度保守区域。在获得的保守区基因序列中使用iCODEHOP生物信息学软件的默认参数设计VH5'引物。编码VH基因FR4的胚系基因J片段(JH)有13个核苷酸序列放在一组中自行找出保守区。3'引物是通过13个JH核苷酸序列的保守区手动设计。　　 二、VH基因的扩增　　 从沈阳市传染病院共获得HFRS恢复期患者外周血30份,每位患者取外周血5mL,用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。参照RNA提取试剂盒使用说明,提取总RNA。按照TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Version3.0说明进行第一链反转录合成cDNA。以cDNA为模板,应用自主设计的寡核苷酸引物混合物(ConsensusDE-generateHybridOligonucleotidePrimers,CODEHOP),应用聚合酶链反应(polymerabechainreaction,PCR)扩增抗体重链可变区基因。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。使用凝胶回收试剂盒纯化后连入PMD18-T载体中,使用通用引物对多个单克隆进行测序分析。　　 三、人全部Ig可变区基因的套式PCR引物设计　　 从数据库中获得人Ig重链(VH)、轻链(包括VK和VL)胚系基因序列:前导序列(Leadersequence,L)、V基因片段、J基因片段、恒定区(Constantregion,C)。根据胚系基因家族的不同分组,在每组中通过多序列对比软件GeneDoc进行分析,手动设计引物。　　 四、人全部Ig可变区基因的扩增　　 以cDNA为模板,应用针对不同胚系基因家族的第一套引物分别扩增人重链和轻链可变区基因。将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,使用凝胶回收试剂盒回收目的基因片段。以纯化的目的片段为模板,用第二套引物扩增可变区基因,再将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化。　　 五、ScFv基因的拼接及鉴定　　 (一)重叠延伸PCR(genesplicingbyoverlapextensionPCR,SOE-PCR)拼接ScFv基因　　 将第二套引物扩增后回收的VH、VK(L)基因片段随机组合、分次连接,按常规SOE-PCR法进行连接反应,连接后电泳鉴定并纯化。　　 (二)ScFV基因的鉴定　　 PCR产物凝胶回收后连接pMD18-T载体,转化感受态菌TG1,提取多个单克隆后送至TAKARA公司测序分析。　　 六、抗汉坦病毒免疫噬菌体抗体库的构建　　 (一)ScFv与噬粒载体连接　　 ScFv的连接产物凝胶回收后经sfi1、Not1双酶切,用片段纯化试剂盒进行回收。将其与Sfi1、Not1双酶切的噬粒载体pCANTAB5E连接。将全部连接产物加入至100μL感受态菌E.coliTG1中进行转化,转化产物一部分冻存,一部分涂于SOBAG琼脂平板上,37℃过夜培养。挑取SOBAG琼脂板上的单菌落,提取质粒进行酶切鉴定后,送测序。　　 (二)抗体库的构建及容量测定　　 900μL冻存菌种加入至9.1mL2×YT-G培养基中,37℃培养1h,向培养物中加入50μL,20mg/mLAmp和4×1010pfu的M13K07(加入的体积=4×1010pfu÷M13K07pfu/mL。37℃培养1h,1000g离心10min,弃上清,10mL2×YT-AK培养基重悬后,37℃过夜培养。将所得文库做10-8、10-10、10-12、10-14、10-16梯度稀释,进行噬菌斑培养实验,观察噬菌斑生长情况以估算ScFv噬菌体抗体库的滴度。　　 结果：　　 一、VH基因的引物设计　　 应用iCODEHOP设计简并引物共获得7条5'引物。根据13条胚系基因J片段的核苷酸序列手动设计获得1条3'引物,分别与7条5'引物配对使用。这套引物可以扩增人Ig重链可变区FR1至FR4。　　 二、VH基因的扩增　　 应用自主设计的引物,经RT-PCR扩增获得VH基因。每对引物扩增的基因大小都与预期一致,大小约为3501bp,由于5'引物的结合位点不同导致产物片段大小有些许差异。　　 三、VH基因多样性分析　　 为了鉴定PCR产物的特异性和多样性,将PCR产物纯化,克隆入PMD18-T载体中,转化TG1菌,多个单克隆提取后测序,序列分析均为人Ig重链可变区基因。对编码VH基因序列的胚系基因来源进行了分析,显示了其多样性。　　 四、人全部Ig可变区基因的套式PCR引物设计　　 根据胚系基因数据库手动设计两套引物,第一套引物的结合位点为前导序列和恒定区:其中VH5'引物6条,3'引物2条,VK5'引物6条,3'引物1条,VL5'引物7条,3'引物1条,共形成25种组合。第二套引物的结合位点为V区和J区,并且在引物中引入了国际通用linker序列:其中VH5'引物5条,3'引物1条,VK5'引物4条,3'引物2条,VL5'引物7条,3'引物2条,共形成27种组合。VH引物5'端引入了酶切位点Sfi1,VK(L)3'端引入了酶切位点Not1。　　 五、全套VH、VL基因片段的扩增和鉴定　　 (一)用第一套引物扩增可变区基因片段　　 以cDNA为模板,PCR扩增后,VH基因片段大小约为500多bp,VK、VL基因片段大小约为400bp,与预期结果一致。　　 (二)用第二套引物扩增可变区基因片段　　 以第一套引物扩增的可变区基因片段纯化产物为模板,PCR扩增后,VH、VK、VL基因片段大小约为350bp,与预期结果一致。　　 六、单链抗体的拼接及鉴定　　 (一)SOE-PCR拼接ScFv基因　　 将5种VH基因片段与22种VK/NL基因片段两两配对连接,共获得40种VH-liker-VK和70种VH-linker-VL组合。拼接后的ScFv大小为750bp,与预期结果一致。　　 (二)ScFv的测序鉴定　　 测序结果表明,ScFv包含完整的可变区基因框架区、互补决定区,在VH、VL基因中间为正确的linker序列,与预期结果一致。　　 七、抗汉坦病毒免疫噬菌体抗体库的构建　　 (一)噬粒载体pCANTAB5E-ScFv的鉴定　　 用EcoR1单酶切载体pCANTAB5E及pCANTAB5E-ScFv,大小分别为4.5kb、5.4kb,与预期结果相符。将多个单克隆测序分析验证了ScFv基因的正确性及多样性。　　 (二)噬斑测定抗体库容量　　 对10个稀释倍数为10-14的噬斑平板计数,取平均值。测定抗体库的容量为2.9×1016。　　 结论：　　 1、应用iCODEHOP设计了VH5'引物7条,手动设计VH3'引物1条;　　 2、PCR扩增获得了VH基因,经测序分析显示了序列的多样性;　　 3、手动设计两套Ig可变区引物,采用套式PCR成功扩增获得VH、VK、VL基因片段;　　 4、采用SOE-RCR成功拼接ScFv基因;　　 5、构建了大容量抗汉坦病毒免疫ScFv噬菌体抗体库,库容量可达2.9×1016。