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目的:环氧酶-2(COX-2)在肝细胞癌发病中的作用近年来逐渐被认识,COX-2可能通过促进细胞增殖抑制凋亡,增强癌细胞侵袭转移能力,促进肿瘤血管生成等多方面的作用参与肝细胞癌的发生和发展。目前多认为COX-2的作用是通过前列腺素E2(PGE2)产生的,后者与胞膜EP受体结合后发挥促肿瘤生长和转移的作用,但具体的细胞内信号转导通路尚不清楚。
Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路在调控细胞的生长、运动和分化,以及在胚胎发育和肿瘤发生及侵袭转移过程中起重要作用,已被确认是与肿瘤相关的一个关键性信号通路。近年来的研究发现在30％～40％的肝细胞癌细胞中存在β-catenin的高表达和核内聚集,Wnt/β-catenin信号通路在肝癌细胞中被激活。本课题拟研究COX-2和PGE2对人肝细胞癌Hep3B细胞增殖以及细胞内Wnt/β-catenin信号通路的调控作用,试图阐明COX-2促肝癌生长的分子机制。
方法:一、采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测人肝细胞癌Hep3B细胞和人正常肝细胞系QSG7701细胞内COX-2mRNA和PGE2 EP受体mRNA的表达,CCK-8细胞计数法检测PGE2、特异性的EP2受体激动剂布他前列素(butaprost)、EP3/EP4受体激动剂乙醇前列腺素E1(PGE1 alcohol)以及选择性的COX-2抑制剂尼美舒利对细胞增殖活性的影响,并观察PGE2对尼美舒利作用的影响,确定药物作用的量效和时效关系。
二、用阳离子脂质体对Hep3B细胞进行COX-2 siRNA(small interferingRNA)的转染,RT-PCR检测COX-2 mRNA表达水平的变化,CCK-8细胞计数法检测COX-2基因表达下调后对细胞增殖活性的影响。
三、设计靶向COX-2基因的RNA干扰序列,构建作用于COX-2 mRNA的发卡状RNA(COX-2 shRNA)的表达载体,进行Hep3B细胞转染,并筛选稳定表达COX-2 shRNA的细胞。采用RT-PCR检测COX-2 mRNA表达水平的变化,CCK-8法考察COX-2 shRNA表达质粒转染Hep3B细胞后对细胞增殖的影响。
四、将用以检测β-catenin/TCF/LEF转录活性的荧光素酶报告质粒TOPflash和FOPflash转染肝癌Hep3B细胞,使用双荧光素酶报告系统分别测定PGE2、butaprost、尼美舒利和COX-2shRNA对细胞内荧光素酶转录活性的影响,以确定PGE2和COX-2是否影响β-catenin/TCF/LEF的转录活性。对Hep3B细胞进行β-catenin siRNA的转染,检测β-catenin基因表达下调后对PGE2促细胞增殖作用的影响,阐明Wnt/β-catenin信号通路是否与PGE2的促生长效应相关。
五、采用免疫印迹技术分别检测PGE2和COX-2shRNA对肝癌Hep3B细胞内β-catenin和磷酸化β-catenin(Ser33/37/Thr41)的影响,探讨PGE2和COX-2对β-catenin的作用。采用免疫印迹技术检测PGE2刺激Hep3B细胞后,细胞内糖原合成激酶-3β(GSK-3β)、磷酸化的GSK-3β(Ser9)、蛋白激酶B(Akt)和磷酸化Akt(Thr308)蛋白水平的变化,并观察磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)抑制剂沃曼青霉素(wortmannin,WM)预处理Hep3B细胞后再给予PGE2刺激,细胞内Akt、GSK-3β磷酸化水平和β-catenin/TCF/LEF转录活性的变化,探讨PGE2是否通过PI3K-Akt途径对GSK-3β磷酸化后激活Wnt/β-catenin信号通路。
结论:PGE2和EP2受体激动剂促进表达COX-2和EP受体的肝细胞癌Hep3B细胞的增殖,而COX-2抑制剂和COX-2基因下调均能抑制Hep3B细胞的增殖,表明COX-2和其催化生成的PGE2具有促进肝细胞癌生长的作用,此作用可能通过细胞膜上的EP2受体介导。PGE2抑制Hep3B细胞内β-catenin蛋白的磷酸化,增加Hep3B细胞内β-catenin蛋白含量,增强β-catenin/TCF/LEF的转录活性:EP2受体激动剂butaprost显著增强β-catenin/TCF/LEF的转录活性,作用与PGE2类似；COX-2基因表达下调促进Hep3B细胞内β-catenin蛋白的磷酸化,降低Hep3B细胞内β-catenin蛋白水平,抑制β-catenin/TCF/LEF的转录活性；COX-2抑制剂尼美舒利显著抑制β-catenin/TCF/LEF的转录活性,此作用可被PGE2削弱；β-catenin基因下调显著抑制PGE2的促增殖作用。上述结果表明COX-2和其催化生成的PGE2通过抑制细胞内β-catenin蛋白的磷酸化和降解,增强β-catenin/TCF/LEF的转录活性,产生促进Hep3B细胞增殖的作用。PGE2促进Hep3B细胞Akt和GSK-3β的磷酸化,此作用可被PI3K特异性的抑制剂WM所阻断。WM同时可对抗PGE2增强β-catenin/TCF/LEF转录活性的作用,此结果提示,PGE2通过活化PI3K-Akt通路,磷酸化下游GSK-3β激酶,进而抑制β-catenin降解,从而激活β-catenin/TCF/LEF依赖的基因转录。
综上所述,COX-2和PGE2通过EP2受体和PI3K-Akt途径激活Wnt/β-catenin通路,从而发挥促进肝细胞癌Hep3B细胞生长的作用。
Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路在调控细胞的生长、运动和分化,以及在胚胎发育和肿瘤发生及侵袭转移过程中起重要作用,已被确认是与肿瘤相关的一个关键性信号通路。近年来的研究发现在30％～40％的肝细胞癌细胞中存在β-catenin的高表达和核内聚集,Wnt/β-catenin信号通路在肝癌细胞中被激活。本课题拟研究COX-2和PGE2对人肝细胞癌Hep3B细胞增殖以及细胞内Wnt/β-catenin信号通路的调控作用,试图阐明COX-2促肝癌生长的分子机制。
方法:一、采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测人肝细胞癌Hep3B细胞和人正常肝细胞系QSG7701细胞内COX-2mRNA和PGE2 EP受体mRNA的表达,CCK-8细胞计数法检测PGE2、特异性的EP2受体激动剂布他前列素(butaprost)、EP3/EP4受体激动剂乙醇前列腺素E1(PGE1 alcohol)以及选择性的COX-2抑制剂尼美舒利对细胞增殖活性的影响,并观察PGE2对尼美舒利作用的影响,确定药物作用的量效和时效关系。
二、用阳离子脂质体对Hep3B细胞进行COX-2 siRNA(small interferingRNA)的转染,RT-PCR检测COX-2 mRNA表达水平的变化,CCK-8细胞计数法检测COX-2基因表达下调后对细胞增殖活性的影响。
三、设计靶向COX-2基因的RNA干扰序列,构建作用于COX-2 mRNA的发卡状RNA(COX-2 shRNA)的表达载体,进行Hep3B细胞转染,并筛选稳定表达COX-2 shRNA的细胞。采用RT-PCR检测COX-2 mRNA表达水平的变化,CCK-8法考察COX-2 shRNA表达质粒转染Hep3B细胞后对细胞增殖的影响。
四、将用以检测β-catenin/TCF/LEF转录活性的荧光素酶报告质粒TOPflash和FOPflash转染肝癌Hep3B细胞,使用双荧光素酶报告系统分别测定PGE2、butaprost、尼美舒利和COX-2shRNA对细胞内荧光素酶转录活性的影响,以确定PGE2和COX-2是否影响β-catenin/TCF/LEF的转录活性。对Hep3B细胞进行β-catenin siRNA的转染,检测β-catenin基因表达下调后对PGE2促细胞增殖作用的影响,阐明Wnt/β-catenin信号通路是否与PGE2的促生长效应相关。
五、采用免疫印迹技术分别检测PGE2和COX-2shRNA对肝癌Hep3B细胞内β-catenin和磷酸化β-catenin(Ser33/37/Thr41)的影响,探讨PGE2和COX-2对β-catenin的作用。采用免疫印迹技术检测PGE2刺激Hep3B细胞后,细胞内糖原合成激酶-3β(GSK-3β)、磷酸化的GSK-3β(Ser9)、蛋白激酶B(Akt)和磷酸化Akt(Thr308)蛋白水平的变化,并观察磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)抑制剂沃曼青霉素(wortmannin,WM)预处理Hep3B细胞后再给予PGE2刺激,细胞内Akt、GSK-3β磷酸化水平和β-catenin/TCF/LEF转录活性的变化,探讨PGE2是否通过PI3K-Akt途径对GSK-3β磷酸化后激活Wnt/β-catenin信号通路。
结论:PGE2和EP2受体激动剂促进表达COX-2和EP受体的肝细胞癌Hep3B细胞的增殖,而COX-2抑制剂和COX-2基因下调均能抑制Hep3B细胞的增殖,表明COX-2和其催化生成的PGE2具有促进肝细胞癌生长的作用,此作用可能通过细胞膜上的EP2受体介导。PGE2抑制Hep3B细胞内β-catenin蛋白的磷酸化,增加Hep3B细胞内β-catenin蛋白含量,增强β-catenin/TCF/LEF的转录活性:EP2受体激动剂butaprost显著增强β-catenin/TCF/LEF的转录活性,作用与PGE2类似；COX-2基因表达下调促进Hep3B细胞内β-catenin蛋白的磷酸化,降低Hep3B细胞内β-catenin蛋白水平,抑制β-catenin/TCF/LEF的转录活性；COX-2抑制剂尼美舒利显著抑制β-catenin/TCF/LEF的转录活性,此作用可被PGE2削弱；β-catenin基因下调显著抑制PGE2的促增殖作用。上述结果表明COX-2和其催化生成的PGE2通过抑制细胞内β-catenin蛋白的磷酸化和降解,增强β-catenin/TCF/LEF的转录活性,产生促进Hep3B细胞增殖的作用。PGE2促进Hep3B细胞Akt和GSK-3β的磷酸化,此作用可被PI3K特异性的抑制剂WM所阻断。WM同时可对抗PGE2增强β-catenin/TCF/LEF转录活性的作用,此结果提示,PGE2通过活化PI3K-Akt通路,磷酸化下游GSK-3β激酶,进而抑制β-catenin降解,从而激活β-catenin/TCF/LEF依赖的基因转录。
综上所述,COX-2和PGE2通过EP2受体和PI3K-Akt途径激活Wnt/β-catenin通路,从而发挥促进肝细胞癌Hep3B细胞生长的作用。