研究背景 随着技术的改良和不断进步,接受体外受精-胚胎移植（IVF-ET）妇女的妊娠结局包括临床妊娠率和活产率等均明显提高。IVF-ET的成功主要取决于参与植入的基本两个要素:子宫内膜和胚胎。随着胚胎实验室技术的迅速发展,质量差的胚胎可以很容易在植入前筛选出来,只留下质量好的胚胎用于移植,因此胚胎质量问题在很大程度上得到了解决。相比之下,子宫内膜容受性降低的问题往往更常见,而且也更难以诊断和治疗。由于人们生活方式的改变以及机械、药物、微生物等原因引起的子宫内膜损伤在临床上也变得越来越常见,子宫内膜损伤会直接导致子宫内膜变薄,同时可能并发有纤维化,导致子宫内膜容受性降低。因损伤导致的薄型子宫内膜一直是辅助生殖领域中最具挑战性的问题。子宫内膜是影响胚胎植入和妊娠结局的主要因素,当子宫内膜受到严重损伤,比如反复刮宫、子宫内膜炎、子宫缺血等病理情况下,子宫基底层受到损伤,基底层的细胞增殖生成功能层的能力受损,其最主要且最直接的表现是子宫内膜变薄。同时,受损的子宫内膜在完成自我修复的过程中可能会发生病理性修复,产生程度不等的纤维化,严重时甚至导致宫腔因粘连而闭塞。薄型子宫内膜的危害并不仅仅是外观上厚度变薄,更重要的是子宫内膜容受性降低,包括子宫内膜功能层血流减少以及影响子宫内膜容受性的各种细胞因子的改变。患有薄型子宫内膜的女性生育能力受损,表现为妊娠率降低、妊娠结局不佳和反复流产。因此发生子宫内膜损伤后,改善薄型子宫内膜及预防纤维化成为治疗的关键。富血小板血浆是将血液离心浓缩获得的的包含有高浓度血小板的生物制品,血小板内含有三种颗粒:ɑ-颗粒、β–颗粒、溶酶体,其中ɑ-颗粒包含有多种生长因子和细胞因子,血小板在人体内主要的生理功能为防止血管损伤部位失血,从而在止血中发挥重要作用。血小板还可以促进损伤部位的修复,释放促进组织修复的物质,促进细胞增殖、迁移,并影响其他血细胞在血管生成和炎症中的反应性。同时,这些生长因子和细胞因子对于成纤维细胞的活化和将白细胞募集到损伤部位、诱导和调节参与组织修复的其他类型细胞的增殖和迁移至关重要。基于富血小板血浆促进组织修复的特性,而子宫内膜损伤宏观上也属于组织损伤,那么富血小板血浆是否可以应用于子宫内膜的组织修复,是否可以应用于治疗子宫内膜损伤后的薄型子宫内膜,是否可以预防纤维化,我们进行了这项课题,初步探索PRP在治疗薄型子宫内膜及预防纤维化。研究目的 子宫内膜上皮细胞无法在体外培养传代,而人子宫内膜癌细胞（HEC-151细胞）与子宫内膜上皮细胞具有相同的生物学特性,因此本研究的细胞实验中以HEC-151细胞代替子宫内膜上皮细胞。首先探讨PRP对HEC-151细胞增殖、迁移的作用。并且用流式细胞仪评估PRP对HEC-151细胞周期的影响。初步探讨PRP促细胞增殖的作用及其机制;在动物实验中,我们通过向子宫腔内注入95%乙醇制作了小鼠损伤后薄型子宫内膜模型,通过苏木精和伊红染色、蛋白质印迹分析和逆转录聚合酶链反应分析了子宫内膜损伤小鼠模型宫腔灌注PRP后子宫内膜形态、容受性和纤维化相关因子的表达。同时,我们还分析了小鼠胚胎植入部位的数量和妊娠结局。初步探讨了PRP治疗子宫内膜损伤且改善妊娠结局的效果和潜在机制。最后,我们评估了PRP宫腔灌注对75名薄型子宫内膜女性的治疗效果,并以同期诊断为薄型子宫内膜的86名患者为对照,观察PRP宫腔灌注对子宫内膜厚度、血流以及妊娠结局的影响,以期在临床上应用PRP治疗薄型子宫内膜提供依据。研究方法（1）第一部分研究中,抽取3名健康女性外周静脉血,使用两步离心法分离制备PRP。使用添加梯度浓度PRP（20%、10%、5%、2.5%）的培养液培养HEC-151细胞,用CCK-8法检测各组细胞在24 h、48 h、72 h、96 h的增值情况并绘制增殖曲线;使用Transwell法和划痕实验检测PRP对HEC-151细胞迁移能力的影响。最后,流式细胞仪检测PRP对HEC-151细胞增殖的影响,初步探寻PRP促进细胞增殖的机制。（2）第二部分研究中,进行了三个实验,95%乙醇注入宫腔制作损伤后薄型子宫内膜小鼠模型,实验1给予小鼠模型宫腔灌注PRP治疗后,通过苏木精和伊红染色观察子宫内膜厚度、微血管的改变;通过免疫组化、免疫印迹、反转录PCR检测子宫内膜功能和容受性标记物:细胞角蛋白-19（Cytokeratin-19,CK-19）、波形蛋白（Vimentin）、血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）、整合素-β3（Integrin-β3）、以及纤维化标志物转化生长因子（Transforming growth factor-β,TGF-β）和α-平滑肌肌动蛋白（α-Smooth muscle actin,α-SMA）的表达;实验2调查了妊娠中期的胚胎植入结果（植入部位的数量,胚胎发育,植入部位的重量）,以评估PRP处理在怀孕第12天时对胚胎的生长和发育的影响。实验3评估了小鼠的妊娠结局（受孕时间、活产率、产仔数）。（3）第三部分研究中,回顾性分析因既往移植日子宫内膜厚度＜7 mm而取消胚胎移植,本周期行冻融胚胎移植患者161例。分为两组,激素替代组86例（对照组）和激素替代联合PRP宫腔灌注组75例（观察组）,检测并分析治疗前后两组子宫内膜增厚情况,子宫内膜下血流情况及临床结局。结果（1）将不同浓度PRP加入培养液,对HEC-151细胞培养后发现:不同终浓度的PRP对HEC-151细胞增殖的作用也不同,20%PRP组的HEC-151细胞的增殖活性最大;10%PRP组对HEC-151细胞的增殖活性略低于20%PRP组,但两组间没有统计学差异;2.5%PRP组和5%PRP组的HEC-151细胞增殖活性最弱（P＜0.01）。（2）Transwell实验和划痕实验的结果表明PRP可以促进HEC-151细胞的迁移。（3）制作小鼠损伤后薄型子宫内膜模型后行宫腔灌注PRP治疗,通过实验1发现:PRP宫腔灌注可以改善薄型子宫内膜小鼠模型的子宫内膜厚度和子宫内膜容受性,其中包括子宫内膜形态学指标（内膜厚度、及微小血管的增加）和子宫内膜容受性指标（CK9、VIM、VEGF、Integrin-β3）;此外,PRP还能预防纤维化（α-SMA,TGF-β）。具体来说,苏木精和伊红染色和MT染色证实,与损伤组相比,PRP治疗组的纤维化显著减少,子宫内膜厚度增加。通过免疫组织化学和蛋白质免疫印迹实验发现:与损伤组相比,PRP处理组中CK9、Vimentin、VEGF、整合素-β3的表达显著增强。在反转录PCR分析中,与损伤组相比,PRP处理组的CK9、Vimentin、VEGF、Integrin-β3表达同样显著增强,而纤维化标志物α-SMA,TGF-β表达显著降低。在实验2中,检查了植入部位和胚胎,以评估PRP治疗对怀孕第12天小鼠的生长和发育的影响。正常组小鼠的植入部位显示出正常的大体形态,而损伤后薄型子宫内膜小鼠未经处理的子宫角的植入部位出现异常,数量较少。在PRP处理的子宫角中植入部位的数量明显高于薄型子宫内膜小鼠未处理的角。在妊娠第12天收集的植入部位的重量分布方面,PRP处理和未处理的薄型子宫内膜小鼠的角没有观察到明显差异。这些结果表明,PRP治疗可以改善胚胎种植能力,这反映在薄型子宫内膜小鼠经PRP宫腔灌注治疗后的植入部位数量更多。在实验3中,正常组小鼠平均需要2.3±1.28天受孕,薄型子宫内膜小鼠平均需要20.5±1.74天,而PRP处理的薄型子宫内膜小鼠只需6.5±1.07天（P＜0.01）。这些结果表明胚胎植入能力会因为子宫内膜损伤而下降,但可以通过PRP治疗恢复,尽管不能恢复到损伤前的水平。所有正常组小鼠都生下了活的幼崽,但薄型子宫内膜小鼠没有生下任何活的幼崽,大多数经PRP治疗的薄型子宫内膜小鼠产下健康的幼崽（P＜0.01）。（4）两组患者治疗后子宫内膜厚度均较治疗前增加（PRP组:7.66±1.68mm vs 5.84±1.39 mm,对照组:6.74±1.73 mm vs 5.87±0.81 mm）,PRP组子宫内膜厚度增加幅度高于对照组（1.81±1.35 mm vs 0.88±1.05 mm）。黄体支持日PRP组B+C血流类型较对照组B+C血流类型显著增加（69.33%vs 36.05%）,PRP组黄体支持日B+C血流类型较PRP灌注日B+C血流类型显著增加（69.33%vs 29.33%）。黄体支持日PRP组子宫动脉搏动指数（PI）、阻力指数（RI）较对照组降低（1.85±0.09 vs 2.23±0.17,0.73±0.04 vs 0.85±0.06）,PRP组黄体支持日PI、RI较PRP灌注日PI、RI降低（1.85±0.09 vs 2.06±0.26,0.73±0.04 vs 0.85±0.04）。PRP组胚胎种植率和临床妊娠率高于对照组（17.98%vs 9.37%,35.48%vs 19.29%）。结论（1）本研究使用不同浓度PRP体外培养HEC-151细胞,发现在20%PRP浓度时,细胞的增殖能力最强,呈剂量依赖性,提示不同浓度PRP对HEC-151细胞的作用效果不同,同时PRP对细胞的迁移也有很强的促进作用。PRP能够通过提高细胞合成DNA的能力和加速细胞周期以促进细胞增殖。（2）PRP可替代FBS及单一生长因子培养HEC-151细胞。（3）在动物实验中,PRP宫腔灌注治疗薄型子宫内膜小鼠,可促进受损子宫内膜増殖修复,提高子宫内膜的容受性,使子宫内膜血流增多,降低子宫内膜的纤维化程度。这种作用可能跟PRP影响HEC-151细胞的生物学功能有关。增加受损子宫中的植入部位数量,提高薄型子宫内膜小鼠的活产率。（4）在临床上,PRP宫腔灌注可增加薄型子宫内膜厚度,改善子宫内膜血流状况,提高胚胎种植率和临床妊娠率。